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Abbau von Peptidketten 09:00 min

Textversion des Videos

Transkript Abbau von Peptidketten

Guten Tag und herzlich willkommen. Dieses Video heißt: Abbau von Peptidketten. An Vorkenntnissen solltest du Wissen über Aminosäuren, Peptide, Amide, die Hydrolyse von Amiden, sowie über Amine und Carbonsäuren mitbringen. Ziel des Videos ist es, grundlegende Vorstellungen über den Peptidabbau und die Analyse von Peptiden zu vermitteln. Der Film ist in fünf Abschnitte unterteilt: 1. Sinnvoller Abbau 2. Hydrolyse 3. Totalhydrolyse 4. Sequenzanalyse 5. Zusammenfassung   1. Sinnvoller Abbau Nehmen wir einmal an, wir haben es mit diesem Molekül zu tun, das ihr sicher schon als Dipeptid erkannt habt. Wie kann man einen Abbau des Moleküls gestalten, um etwas über die Struktur zu erfahren? Eine Möglichkeit wäre die Verbrennung im Sinne einer CHN-Analyse, um etwas über die beteiligten Elemente und ihren Anteil am Bau des Moleküls zu erfahren. Obwohl prinzipiell richtig, ist diese Methode hier nicht sinnvoll einsetzbar, da wir bereits wissen, dass wir es mit Peptiden zu tun haben. Die CHN-Analyse liefert praktisch keine brauchbaren Aussagen über die Struktur eines Moleküls. Wir haben von vornherein schon gewisse Vorstellungen über die Primärstruktur eines Peptids. Das ist ganz offensichtlich, denn wir kennen seine Bausteine, die Aminosäuren. Sinnvoller hingegen ist es, eine Spaltung des Peptids durchzuführen, um schließlich zu den einzelnen Aminosäuren zu gelangen.   2. Hydrolyse Hydrolyse bedeutet Spaltung unseres Peptids durch Wasser. Wir erinnern uns, dass diese Hydrolyse sowohl im sauren, als auch im basischen (alkalischen) Medium stattfinden kann. Somit erhalten wir nach der sauren Variante die Kationen, der am Bau des Peptids beteiligten Aminosäuren. Basische Hydrolyse hingegen führt zu den entsprechenden Anionen der Aminosäuren. Und selbstverständlich läuft die Hydrolyse nur in Anwesenheit von Wasser ab. Nach Bestimmung der Aminosäuren können wir eine Aussage über unser Dipeptid machen. Es besteht aus den beiden Aminosäuren Glyzin und Alanin, wobei es zwei mögliche Isomere gibt. Die basische Hydrolyse hat gegenüber der sauren Hydrolyse zwei wesentliche Nachteile. Als Erstes kann es zu einer Veränderung einiger Aminosäuren kommen. Als Zweites ist die Racemisierung am Alphakohlenstoffatom nicht wünschenswert. Aus diesen Gründen zieht man die saure Hydrolyse der basischen vor.   3. Totalhydrolyse Total bedeutet vollständig, das heißt, mit dieser Hydrolyse soll das Peptidmolekül vollständig hydrolysiert werden. Die Hydrolyse eines Peptidmoleküls kann durch entsprechende Enzyme vonstattengehen. Diese Enzyme nennt man Proteasen oder Peptidasen. Die Enzyme rufen einen biochemischen Abbau hervor. Durch starke Säuren findet ein chemischer Abbau statt. Die Totalhydrolyse von Peptiden, die für die Analyse verwendet wird, möchte ich kurz vorstellen. Die Reaktion findet in einer 6-Molaren-Salzsäure statt. Die Reaktionszeit beträgt 24 Stunden. Die Reaktionszeit liegt bei 105 Grad Celsius. Die Reaktion findet im geschlossenen Rohr statt, damit Chlorwasserstoff und Wasser nicht entweichen können. Unter diesen Bedingungen findet eine Totalhydrolyse statt. Das entstandene Hydrolysat wird für weitere analytische Zwecke verwendet. Im Hydrolysat liegt ein Gemisch von Aminosäuren vor. Das Hydrolysat wird nun der weiteren Analyse zugeführt. Die weitere Untersuchung findet im Wesentlichen automatisch statt. Das Hydrolysat gelangt in den Aminosäuren-Analysator. Die Aminosäuren werden mit dem Verfahren der Ionenaustauschchromatografie getrennt. Den einzelnen Aminosäurenfraktionen wird Ninhydrin zugesetzt. Es bildet sich der bekannte violette Farbstoff. Dieser Farbstoff wird einer quantitativen Analyse unterzogen, indem die Farbintensität untersucht wird. Mit dem vorgestellten Verfahren können Stoffmengen ab 25 nmol, das sind 25×10-9 mol untersucht werden. Wir kennen nun die beteiligten Aminosäuren und ihre Mengen an der Struktur des Peptids. Wir besitzen jedoch noch keinerlei Aussage über die Sequenz der Aminosäuren.

Aus diesem Grund schließt sich 4. Die Sequenzanalyse an. Nehmen wir an, wir haben ein Tripeptid bestehend aus den Aminosäuren Glyzin, Alanin und Phenylalanin. In einem der vorigen Videos haben wir gelernt, dass dieses Tripeptid 6 Konstitutionsisomere bilden kann. Wir wollen nun die Anordnung der Aminosäurenmoleküle im Tripeptid untersuchen. Wir wollen etwas über ihre Sequenz erfahren. Die Kenntnis der Sequenz ist ein weiterer Schritt in Richtung einer vollständigen Strukturaufklärung des Tripeptids. Die Totalsynthese aus Abschnitt 3 ist dafür ungeeignet. Wir benötigen einen stufenweisen Abbau. Eine Möglichkeit, dieses Anliegen zu bewerkstelligen, ist der sogenannte EDMAN-Abbau. Bei dieser Methode führen Nebenprodukte zu Verschmutzungen, sodass man nur 30 bis 40 Stufen vollziehen kann. Daher wird der stufenweise Abbau häufig mit einer Partialhydrolyse des Peptids kombiniert. Die Peptidkette wird weder total noch stufenweise abgebaut, sondern an bestimmten Stellen auseinandergeschnitten. Das geschieht mit bestimmten Enzymen: mit Proteinasen und Peptidasen. Diese sind in der Lage, die Peptidkette an ausgewählten Stellen zu hydrolysieren. Zwei typische Vertreter sind Trypsin und Chymotrypsin. Die analytische Untersuchung wird kombiniert mit den Verfahren Massenspektronometrie (MS), mit FAB, MALDI und ESI.   5. Zusammenfassung Um ein Peptidmolekül, wie dieses Dipeptid abzubauen, sind mehrere Schritte notwendig. Wir wollen Antworten auf zwei wichtige Fragen erhalten. 1. Welche Aminosäuren und in welcher Anzahl sind am Bau des Peptidmoleküls beteiligt? 2. Welche Sequenz haben die beteiligten Aminosäuren? Peptidmoleküle sind durch Hydrolyse in Aminosäuren spaltbar. Die saure Hydrolyse ist der basischen Hydrolyse vorzuziehen. Nach erfolgter Totalhydrolyse des Peptids werden die Aminosäuren mit Ionenaustauschchromatografie getrennt. Die Aminosäuren werden quantitativ bestimmt und wir erhalten eine Aussage über die mengenmäßige Zusammensetzung der Aminosäuren im Peptidmolekül. Eine Aussage über die Primärstruktur der Peptidketten liefert die Sequenzanalyse. Sequenzanalyse geschieht durch EDMAN‘schen Abbau. Bei großen Peptidketten ist dieser mit der Partialhydrolyse gekoppelt. Für die analytischen Untersuchungen werden die Methoden Massenspektronometrie (MS), MALDI, FAB und ESI verwendet. Somit gelingt es zweitens, die Sequenz einer Peptidkette zu ermitteln.   Ich danke für die Aufmerksamkeit. Alles Gute und auf Wiedersehen!

2 Kommentare
  1. Hallo Melissa,

    bei der sauren Hydrolyse gibt es einen Überschuss von H⁺ oder vielmehr H₃O⁺. Daher reagiert das Dipeptid auch mehrfach, bis es in der dargestellten Form vorliegt.

    Liebe Grüße aus der Redaktion

    Von Karsten Schedemann, vor 3 Tagen
  2. Bei der sauren hydrolyse, versteh ich nicht warum bei beiden Aminosäuren NH3 entsteht und zusätzlich die carboxylgruppe der ersten Aminosäure. Müsste das dipeptid dann nicht bei der peptidgruppe 2 h-Atome besitzen und nicht nur eins?
    Oder wäre das Ergebnis ein anderes

    Von Melissa Jovovich, vor 4 Tagen

Abbau von Peptidketten Übung

Du möchtest dein gelerntes Wissen anwenden? Mit den Aufgaben zum Video Abbau von Peptidketten kannst du es wiederholen und üben.

  • Bestimme die Methoden, die zum Abbau von Peptidketten verwendet werden.

    Tipps

    Unter welchen Bedingungen kann die Amidbindung so gespalten werden?

    Durch Einwirkung von Sauerstoff oder Wasserstoff kann die Peptidkette bis in die Elemente zerlegt werden.

    Lösung

    Geeignete und angewendete Methoden, um eine Peptidkette so abzubauen, dass noch Informationen über das Molekül entnommen werden können, sind:

    • Totalhydrolyse (bevorzugt sauer) zu den einzelnen Aminosäuren
    • Edman-Abbau
    • Enzyme wie Proteinasen oder Peptidasen zum biochemischen Abbau
    Es lassen sich auch Aussagen über die Quantität der Aminosäuren machen. Dazu werden die Aminosäuren durch Ionenaustauschchromatographie getrennt und mit Ninhydrin versetzt. Die Intensität des entstandenen Farbstoffes gibt Aussagen über die Quantität.

    Ungeeignet sind Verbrennungen und Oxidationen. Hier können keine sinnvollen Fragmente erhalten werden. Der Abbau erfolgt zu stark. Auch Reaktionen an den Kettenenden, wie z.B. Veresterungen oder andere $S_N$-Reaktionen, können Peptidketten nicht abbauen.

  • Nenne die Ziele vom Peptidkettenabbau.

    Tipps

    Der Peptidabbau zielt immer auf einen Abbau in kleinere Molekülteile ab.

    Woraus bestehen Peptide?

    Lösung

    Der Peptidkettenabbau ist ein wichtiges Verfahren in der Biochemie. Er ist notwendig, um den Aufbau eines natürlichen Proteins aufzuklären. Nur durch solche Methoden war die Strukturaufklärung von z.B. Insulin und dessen chemische Produktion möglich. Wichtige Fragen, die man sich stellt sind:

    • Welche Aminosäuren enthält das Peptid?
    • Welche Anteile haben diese Aminosäuren an dem Peptid?
    • Wie sind die Aminosäuren miteinander verknüpft (Konstitutionsisomere)?
    Die ersten beiden Fragen können nach einer Totalhydrolyse beantwortet werden. Die Aminosäuren aus dem Hydrolysat werden durch die Ionenaustauschchromatographie aufgetrennt (qualitative Analyse) und durch Ninhydrin quantitativ nachgewiesen.

    Die dritte Frage wird durch den Edman-Abbau beantwortet, denn durch diesen kann die Primärstruktur vom Peptid aufgeklärt werden.

  • Erkläre den Nachweis einer Aminosäure mit Ninhydrin.

    Tipps

    Im ersten Reaktionsschritt wird ein Imin gebildet.

    Erst nach einer Decarboxylierung kann sich der Farbstoff bilden.

    Die Iminbildung erfolgt unter Wasserabscheidung.

    Lösung

    Wie in der Darstellung zu sehen ist, laufen folgende Reaktionen ab:

    1. Iminibildung unter Wasserabscheidung durch einen Additions-Eliminierungsmechanismus
    2. Decarboxylierung ($CO_2$ Abspaltung)
    3. Hydrolyse des Amins (Abspaltung des Rests am Stickstoff als Aldehyd) und Kondensation mit Ninhydrin zu Ruhemanns Purpur
  • Erkläre die Vorgehensweise zur Bestimmung der Peptidsequenz.

    Tipps

    Quantitative Analysen dienen zur Bestimmung der Menge eines Stoffes in einer Probe. Dazu nutzt man z.B. Gravimetrie, Photometrie oder Titration.

    Nach der Totalhydrolyse liegen die Aminosäuren in der protonierten, positiv geladenen Form vor.

    Lösung

    Es ist wichtig herauszufinden, wie bestimmte Proteine bzw. Peptide aufgebaut sind, um sie chemisch „nachzubauen“ wie z.B. das Insulin.

    • Zuerst müssen die Aminosäuren, die in dem Molekül vorkommen, bestimmt werden, d.h. durch die saure Totalhydrolyse wird das Peptid in alle seine Aminosäuren (z.B. Tryptophan, Serin, Cystein) zerlegt.
    • Aus dem Hydrolysat werden nun die Aminosäuren durch Ionenaustauschchromatographie getrennt.
    • Nach diesem Schritt werden die einzelnen Aminosäuren mit Ninhydrin umgesetzt, wobei ein violetter Farbstoff entsteht (Nachweis der Aminosäuren). Mittels photometrischer Methoden kann aus der Intensität der Farbe die Konzentration an Aminosäure bestimmt werden.
    Durch die Totalhydrolyse und deren Folgeschritte kann also eine Aussage über Qualität und Quantität der Aminosäuren gemacht werden.

    • Der Edman Abbau dient letztendlich dazu, die Aminosäurensequenz, d.h. die Primärstruktur, zu entwickeln. Dabei wird die N-terminale Aminosäure des Peptids unter Einwirkung von Phenylisothiocyanat abgespalten. Dabei kommt es zur Bildung des um eine Aminosäure verkürzten Peptids und eines Phenylthiohydantoin-Derivats (siehe Abbildung).
  • Identifiziere die Produkte der Totalhydrolyse von folgendem Oligopeptid.

    Tipps

    Bedenke, dass bei der saueren Totalhydrolyse im Gegensatz zur basischen Hydrolyse die Stereokonfiguration erhalten bleibt.

    Die Stereokonfiguration kann über die Fischer-Projektion oder die CIP-Regeln bestimmt werden.

    Nebenstehend ist die Fischer Projektion von L-Alanin bzw. S-Alanin dargestellt.

    Lösung

    Das gezeigte Peptid ist ein Tripetid, weil es zwei Amidbindungen aufweist. Daraus lässt sich erkennen, dass es sich aus insgesamt drei Aminosäuren zusammensetzt. Der Buchstaben-Code für das Peptid lautet: OH-Cys-Ala-Val-H. Damit muss es sich bei den Aminosäuren um Cystein, Valin und Alanin handeln.

    Der Mechanismus des sauren Aufschlusses erfolgt über einen Additions-Eliminierungsmechanismus. Im Gegensatz zur basischen Variante bleibt die Stereokonfiguration erhalten, d.h. die Aminosäuren behalten ihre Konfiguration R, S oder D, L während des Peptidabbaus bei. Die Konfiguration kann über die CIP-Regeln (Cahn-Ingold-Prelog-Nomenklatur) bestimmt werden:

    1. Die Aminofunktion erhält Priorität 1.
    2. Die Carboxygruppe erhält Priorität 2 und der Alkylrest Priorität 3.
    3. Das H-Atom muss nach hinten zeigen.
    Wenn diese Regeln erfüllt sind, wird einfach von Priorität 1 nach 2 nach 3 gesprungen und geschaut, ob man rechts herum (R, D) oder linksherum (S, L) wandert (siehe Abbildung).

  • Erkläre den Edman-Abbau zur Sequenzanalyse von Peptiden.

    Tipps

    Der Substituent -NCS wird Isocyanat genannt.

    Lösung

    Der Edman-Abbau ist eine wichtige Methode zur Sequenzanalyse – ausgehend von der N-terminalen Aminosäure. Zuerst erfolgt der Angriff vom Edman-Reagenz, d.h. dem Phenylisothiocyanat, auf die endständige Stickstoffunktionalität des Peptids. Dabei bildet sich ein Thioharnstoffderivat. Durch den Schwefel wird ein Ringschluss begünstigt, wodurch der Peptidrest abgespalten wird. Die endständige Aminosäure bildet durch Folgereaktionen ein Hydantoin, welches massenspektrometrisch oder chromatographisch analysiert werden kann. Das restliche Peptid unterliegt dieser Reaktion erneut, bis das Peptid in alle Aminosäuren zerlegt wurde.

    Besteht das Peptid aus mehr als 40 Aminosäure-Bausteinen, so kommen Bromcyan oder N-Bromsuccinimid oder auch Enzyme zu Hilfe, die das Peptid hinter bestimmten Aminosäuren teilen. Zum Beispiel spaltet N-Bromsuccinimid selektiv hinter Tryptophan.

    All diese Reaktionen werden heute automatisch im Peptid-Analysator durchgeführt, denn die Sequenzbestimmung spielt eine sehr große Rolle beim Aufbau von Biomolekülen im Labor.