Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) 08:36 min
Transkript Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
Guten Tag und herzlich willkommen, dieses Video heißt Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Und weil der Name so lang ist, wird er auch abgekürzt, wie es häufig in der analytischen Chemie der Fall ist, HPLC. Die Abkürzung stammt aus dem Englischen, High Performance Liquid Chromatographie. Das Video gehört zur Reihe der chromatograpischen Verfahren. Für die notwendigen Vorkenntnisse solltest du die Vorgängervideos aus der Reihe gesehen haben: Dünnschichtchromatographie, Säulenchromatographie und Gaschromatographie. Mein Ziel ist es, hier in diesem Video grundlegende Vorstellungen über die HPLC zu vermitteln. Den Film habe ich in 6 Abschnitte unterteilt: 1. Leistungsvermögen, 2. Prinzipieller Aufbau, 3. Die Säule, 4. NP-Chromatographie und RP-Chromatographie, 5. UHPLC und 6. Zusammenfassung. Beginnen wir dann also gleich mit 1. Leistungsvermögen. "Oh Gott, oh Gott" wird die eine oder der andere stöhnen, wieder eine neue chromatographische Methode. Aber ihr werdet im Laufe des Videos sehen, dass es die HPLC in sich hat. Die HPLC ist, wie jedes chromatographische Verfahren, für die Trennung von Stoffen geeignet. Auch die Stoffindentifizierung ist beim Vorhandensein geeigneter Standards gut möglich. Im Unterschied zur Gaschromatographie ist die HPLC besonders für nicht flüchtige Substanzen ausgelegt. Die Methode kann auch präparativ verwendet werden. Das Trennvermögen ist im Vergleich zur Säulenchromatographie etwa 100 mal größer. Die letzten drei genannten Eigenschaften weist die Gaschromatogrphie nicht oder nur im geringen Maße auf. Und hier haben wir so ein Schmuckstück, ein HPLC-Gerät in einem chemischen Laboratorium. Kommen wir nun zum prinzipiellen Aufbau der Apparatur. Dafür muss ich etwas zeichnen. In dem Schema kann ich 8 signifikante Elemente kennzeichnen. In 1 befindet sich das Elutionsmittel, die mobile Phase. In 2 ist die Pumpe, die einen Druck bis 350 bar aufbauen kann. Bei 3 erfolgt die Probenaufgabe, möglichst schnell und in einem Stück. 4 ist die Trennsäule mit der stationären Phase, meist Kieselgel oder beschichtetes Kieselgel. Bei 5 finden wir den Detektor. Bei 6 sitzt der Signalumwandler, der den beim Detektor erhaltenen Impuls in ein elektrisches Signal umwandelt. Bei 7 wird der Lösungsmittelabfall gesammelt. In 8 finden wir den Millivoltschreiber, mit dessen Hilfe es möglich ist, das Ergebnis zu visualisieren. Zwei Dinge von größter Wichtigkeit sind zu nennen, die die HPLC von der Gaschromatographie unterscheidet. Zum einen ist es, dass die mobile Phase flüssig ist und zum anderen wird hier mit einem hohen Druck gearbeitet. Wir haben bereits bei der Säulenchromatographie gelernt, dass ein hoher Druck zu einer höheren Trennleistung führt. Verlassen wir nun den prinzipiellen Aufbau und kommen wir zur Säule. In der HPLC spielt die Chromatographiesäule, auch kurz Säule genannt, eine große Rolle. Ihre Beschaffenheit hat eine direkte Auswirkung auf das Trennergebnis. Bei der HPLC ist vor der eigentlichen Säule eine Vorsäule, ein Säulenfilter, geschaltet. Der schützt die Säule vor dem Eindringen von Schmutz. In der Säule befindet sich die stationäre Phase. Meist ist das Kieselgel. Typische Längen von HPLC-Säulen liegen im Bereich von 18 bis 300 mm. Der Durchmesser liegt im Bereich von 2 bis 4,6 mm. Präparative Säulen haben einen größeren Säulendurchmesser. Ich habe Werte von 10 mm und 25 mm gefunden. Wir konstatieren. Die Säulen können einen Durchmesser wie bei der Gaschromatographie erreichen. Sie sind aber viel kürzer. Warum, das dürfte auch klar sein. Durch den hohen Druck ist es wichtig, dass das Volumen nicht zu groß wird. Daraus folgt aber, dass Längen und Durchmesser der Säulen relativ gering sind. Kommen wir nun von der Säule zur NP-Chromatographie und RP-Chromatographie. Die HPLC wird in zwei große Varianten unterteilt. In die NP-Chromatographie und in die RP-Chromatographie. NP steht für normal phase, Normalphase. RP steht für reverse phase, Umkehrphase. Im Deutschen ergibt das demzufolge ausgesprochen Normalphasenchromatographie und Umkehrphasenchromatographie. NP-Chromatographie und RP-Chromatographie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer stationären Phase. Bei der NP-Chromatographie ist diese polar, Kieselgel. Bei der RP-Chromatographie ist die stationäre Phase unpolar. Kieselgel wird mit einem unpolaren Stoff beschichtet. Entsprechend finden auch unterschiedliche mobile Phasen bei beiden Varianten Anwendung. Bei der NP-Chromatographie ist die mobile Phase unpolar, bei der RP-Chromatographie polar. Demzufolge kann man bei der NP-Chromatographie Wasser als Eluenten nicht einsetzen. Bei der RP-Chromatographie ist das durchaus möglich. Die Häufigkeit der Anwendung beider Varianten beträgt etwa 25 % zu 75 %. Gehen wir nun über von der NP-Chromatographie und RP-Chromatographie zur UHPLC. UHPLC ist eine weitere Abkürzung aus der analytischen Chemie. Und warum abgekürzt wird, werdet ihr gleich sehen. UHPLC ist die Abkürzung von Ultra High Performance Liquid Chromatography. Und auf Deutsch: Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie. Wir legen auf die HPLC noch einen drauf. Konkret sieht das so aus. Die Korngröße des Kieselgels der stationären Phase wird noch geringer. Der Kormdurchmesser ist geringer als 2 µm. Klar, dass man dann auch einen höheren Druck benötigt. Ein typischer Druck für die UHPLC ist 700 bar. Der apparative Aufwand wird größer, aber die Trennleistung steigt. Da die UHPLC durch einen hohen Arbeitsdruck gekennzeichnet ist, benötigt man für die Apparaturen druckfeste Bauteile. Ganz wichtig sind verschleppungsarme Probengeber. Das bedeutet, man spritzt ein, zack. Es wird also nicht hintereinander und lange dauern, bis die Probe drin ist. Außerdem benötigt man für die UHPLC empfindliche Detektoren. Verlassen wir nun die UHPLC und kommen zur Zusammenfassung. Die HPLC zeigt besonders charakteristische Wesensmerkmale. Die mobile Phase ist im Gegensatz zur Gaschromatographie flüssig. Charakteristisch für die HPLC ist der hohe Arbeitsdruck. Bei der HPLC wird eine geringe Korngröße in der stationären Phase verwendet. Im Ergebnis erzielt man eine hohe Trennleistung und eine kurze Trennzeit. Eine Variante der HPLC ist die NP-Chromatographie, die sogenannte Normalphasenchromatographie. Die stationäre Phase ist hier polar, Kieselgel. Die 2. Variante ist die RP-Chromatographie, die Umkehrphasenchromatographie. Hier ist die stationäre Phase unpolar, beschichtetes Kieselgel. Die HPLC findet Verwendung sowohl im analytischen als auch im präparativen Bereich. Die HPLC kann man mit Fug und Recht als universelle Methode der modernen Chemie bezeichnen. Ich danke für die Aufmerksamkeit. Alles Gute. Auf Wiedersehen.
Videobeschreibung
In diesem Video geht es um die HPLC. Dazu wird zuerst über das Leistungsvermögen geredet, hier erfährst du was die Vorteile der HPLC gegenüber anderen Verfahren hat. Anhand einer Modellzeichnung wird der prinzipielle Aufbau gezeigt. Im Anschluss wird näher auf die Säule selbst eingegangen. Danach werden die 2 Arten der HPLC die sogenannte NP- und die RP- Chromatographie vorgestellt und du lernst was dies bedeutet. Zum Schluss wird dann noch die UHPLC erklärt.
Der Tutor:
Dr. rer. nat.
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Übung
Du möchtest dein gelerntes Wissen anwenden? Mit den Aufgaben zum Video Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) kannst du es wiederholen und üben.
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Beschifte den Aufbau einer HPLC-Anlage.
Tipps
Bei der HPLC findet die Stofftrennung unter hohem Druck statt.
Lösung
Aus dem Lösemittelreservoir gelangt das Lösemittel in die Apparatur, in der die Pumpe einen hohen Druck aufbaut. Durch die Probenaufgabe gelangt das zu untersuchende Stoffgemisch in die Hochdruckapparatur und mischt sich mit dem Lösemittel.
Die Lösung wird durch die Säule gepresst und das Stoffgemisch aufgetrennt.
Detektor und Signalumwandler am Ende der Säule registrieren, wann gelöste Stoffe im Gemisch, das aus der Säule kommt, vorhanden sind und geben das Signal an den mV-Schreiber weiter. Hier wird das Signal als Peak im Chromatogramm sichtbar.
Das Lösemittel wird in einem Abfallbehälter aufgefangen und gesammelt.
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Zeige die Unterschiede zwischen NP- und RP-HPLC auf.
Tipps
Häufig wird das als normal angesehen, was als Erstes entdeckt wurde.
Ist die Stationäre polar, muss die mobile Phase unpolar sein, da sie sonst zu stark miteinander wechselwirken würden. Das würde die Trennleistung verschlechtern.
Lösung
Das Kieselgel, welches häufig bei chromatographischen Verfahren als stationäre Phase verwendet wird, besteht aus Siliciumdioxid, welches an der Außenseite viele Hydroxyl-Gruppen $(-OH)$ trägt. Diese Gruppen sind für den polaren Charakter der stationären Phase verantwortlich.
Da dieses Material bereits seit langer Zeit verwendet wird, wurde es als normal angesehen.
Bei Verwendung einer polaren stationären Phase muss ein unpolares Lösemittel als Eluent verwendet werden. Die Oberfläche des Kieselgels lässt sich jedoch auch mit unpolaren Molekülen beschichten, was die Verwendung von polaren Lösemitteln als mobile Phase möglich macht. Da die Polaritäten hier umgekehrt sind, wird dies als Umkehrphasen-Chromatographie (englisch: reverse phase) bezeichnet. Dies ist ein großer Vorteil, da sich viele Stoffe nicht in unpolaren Lösemitteln lösen und sich daher auch nicht mit Hilfe von chromatographischen Methoden, mit Kieselgel als stationärer Phase, analysiert werden können.
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Prüfe die Aussagen zur HPLC.
Tipps
Wird bei der NP-Chromatographie ein polares oder ein unpolares Lösemittel verwendet?
Bei der Gaschromatographie werden sehr geringe Mengen der Probensubstanz verwendet.
Lösung
Die HPLC vereinigt Vorteile der Gas- und Säulenchromatographie in sich. Das Trennverfahren ähnelt dem der Säulenchromatographie. Daher können auch hier die analysierten Verbindungen durch Wechseln des Auffangbehälters zur richtigen Zeit voneinander getrennt werden.
Da die Verbindungen nicht verdampft werden müssen, werden empfindliche Stoffe durch die HPLC nicht verändert oder zerstört. Außerdem können größere Mengen eingesetzt werden als bei der Gaschromatographie, was wünschenswert ist, wenn hinterher mit den gereinigten Substanzen weitergearbeitet werden soll. //Durch die kleinere Korngröße des Säulenmaterials wird eine größere aktive Oberfläche der stationären Phase erreicht. Zusätzlich kann so ein höherer Arbeitsdruck bei sinnvoller Durchflussrate erzielt werden. Dies führt im Vergleich zur Säulenchromatographie zu einer besseren Trennleistung, die sogar noch über der Trennleistung der Gaschromatographie liegt. Durch den hohen Druck ist die Methode weniger zeitintensiv als die Säulenchromatographie. //
In biologischen Systemen ist meist Wasser das Lösemittel, daher sind biologisch wichtige Verbindungen häufig nicht gut in unpolaren Lösemitteln löslich. Um eine HPLC durchführen zu können, müssen die Verbindungen jedoch gelöst vorliegen. Daher muss häufig ein polares Lösemittel und dementsprechend eine unpolare stationäre Phase verwendet werden. Dafür kann die RP-HPLC genutzt werden.
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Analysiere ein HPLC-Chromatogramm.
Tipps
Je stärker die Adsorbtion an die stationäre Phase ist, desto länger dauert es, bis eine Verbindung durch die Säule gelaufen ist.
Jede polare funktionelle Gruppe eines Moleküls kann mit der stationären Phase wechselwirken.
Lösung
Die Wechselwirkungen zwischen Molekülen, die Hydroxyl-Gruppen tragen, sind besonders hoch, da zwischen diesen Gruppen Wasserstoffbrückenbindungen entstehen können. Daher beeinflussen die Hydroxyl-Gruppen sehr stark die Adsorbtion einer Verbindung an das Kieselgel-Substrat.
Je mehr $OH$-Gruppen ein Molekül trägt, desto mehr Wasserstoffbrückenbindungen kann es zur polaren stationären Phase ausbilden. Das Phloroglucin trägt drei $OH$-Gruppen und wird daher wesentlich stärker an das Kieselgel gebunden als die übrigen Verbindungen. Daher braucht es auch die längste Zeit, um durch die Säule zu wandern. Das zugehörige Signal im Chromatogramm liegt also ganz rechts.
Das Phenol trägt immerhin eine Hydroxyl-Gruppe, daher braucht es deutlich länger als das Benzol, bis diese Verbindung den Detektor erreicht. Im Chromatogramm erscheint das Signal des Phenols daher rechts von dem des Benzols. -
Schildere den Unterschied zwischen HPCL und UHPLC.
Tipps
Bei HPLC und UHPLC können Stoffe mit hohem Siedepunkt problemlos analysiert werden.
Lösung
Bei der UHPLC – der ultra high performance chromatography – wird eine bessere Trennleistung erreicht als bei der normalen HPLC. Dies wird dadurch erreicht, dass das Material in der Säule eine geringere Korngröße aufweist. Dadurch ist die aktive Oberfläche der stationären Phase wesentlich höher und daher sind die Wechselwirkungen zwischen stationärer Phase und den zu trennenden Stoffen größer. Auch der Druck in der Apparatur ist mit bis zu 700 bar deutlich höher, was ebenfalls zu einer Verbesserung der Trennleistung führt.
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Beschreibe die Chromatogramme.
Tipps
Wie äußert sich eine zu große Wechselwirkung mit der stationären Phase?
Starke Wechselwirkungen mit der mobilen Phase führen zu einer geringen Adsorption.
Lösung
Die untersuchten Verbindungen unterscheiden sich in der Anzahl der $OH-$Gruppen, es gilt: je mehr $OH-$Gruppen vorhanden sind, desto polarer ist die Verbindung. Bei Verwendung einer unpolaren stationären Phase (RP-HPLC) werden diejenigen Verbindungen am stärksten von der stationären Phase adsorbiert, die am wenigsten polar sind. Die polareren Verbindungen hingegen werden vom Lösemittel besser eluiert. Dies führt dazu, dass hier die polaren Verbindungen im Chromatogramm auf der Zeitachse weiter links erscheinen als die unpolaren Verbindungen. Das Chromatogramm ist also im Vergleich zum NP-Chromatogramm gespiegelt.
Da bei den gezeigten Chromatogrammen die gleiche Probe verwendet wurde, lassen sich die Verbindungen den Signalen zusätzlich auch über die Intensität der Signale zuordnen. Hieran ist deutlich zu erkennen, dass das RP-Chromatogramm dem gespiegelten NP-Chromatogramm entspricht. //
Wird bei der RP-Chromatographie dieser Probe eine zu unpolare stationäre Phase verwendet, ist das resultierende Chromatogramm unbrauchbar. Da alle drei Verbindungen, dank vorhandener $OH-$Gruppen, polaren Charakter haben, ist die Wechselwirkung mit der mobilen Phase bei allen Verbindungen deutlich stärker als mit der stationären Phase. Daher werden alle Verbindungen nur schwach von der stationären Phase adsorbiert und gelangen mit ähnlich hoher Geschwindigkeit durch die Säule. Im Chromatogramm äußert sich dies darin, dass die Signale aller Verbindungen zusammenfallen, es ist also nur ein großes Signal zu erkennen. Dieses liegt auf Grund der geringen Adsorption sehr weit links im Chromatogramm. Die Trennleistung ist also so gering, dass die Verbindungen nicht getrennt werden können. //
Ähnlich ist es bei Verwendung eines zu unpolaren Lösemittels bei der NP-Chromatographie: Hier sind die Wechselwirkungen mit der mobilen Phase bei allen drei Verbindungen zu gering. Alle drei Verbindungen werden daher von der stationären Phase stark adsorbiert und gelangen nur langsam durch die Säule. Auch dies führt zu einer sehr geringen Trennleistung, was sich im Chromatogramm erkennen lässt. Da dieses Mal die Wechselwirkungen mit der stationären Phase groß sind, liegt das Signal sehr weit rechts auf der Zeitachse. //
Bei Verwendung eines zu hohen Arbeitsdrucks läuft das Gemisch zu schnell durch die Säule. Bei Verwendung der richtigen Kombination von Eluent und Säulenmaterial ist die Trennleistung zwar hoch, jedoch liegen die Signale sehr nah beieinander und weit links auf der Zeitachse.
Gutes Video,
Erwähnenswert wäre noch, dass die Säulen bei der HPLC aus Metall gefertigt sind und nicht mehr aus Glas, um den hohen Arbeitsdruck standzuhalten und das beim präparativen Arbeiten dem Detektor noch ein Fraktionssammler nachgeschaltet ist.
mfg
mfg