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Klonierung – Angewandte Gentechnik 11:54 min

Textversion des Videos

Transkript Klonierung – Angewandte Gentechnik

Hallo! Willkommen zum Video “Angewandte Gentechnik – Klonierung”. In diesem Video beantworten wir die Frage: Was ist Klonierung und wie wird diese durchgeführt? Als konkretes Anwendungsbeispiel besprechen wir die Insulinherstellung. Wir gehen näher auf die molekularbiologische Methode der Klonierung mit Hilfe bakterieller Plasmide ein. Damit du dieses Video optimal verstehst, solltest du folgendes Vorwissen aufweisen: Du bist ja bereits mit dem Grundlagen der Gentechnik vertraut. Du weißt, was Eukaryoten und Prokaryoten sind und wie sich diese unterscheiden. Du solltest schon was von Restriktionsenzym gehört haben und wissen, wie diese molekularen Scheren funktionieren. Es ist wichtig, dass du das Grundprinzip der Proteinbiosynthese verstanden hast, also den Weg vom Gen zum Protein. Was ist also Klonierung? Klonierung ist in der Molekularbiologie der Überbegriff für Methoden zur Gewinnung und identischen Vervielfachung von DNA. Achtung! Der Begriff ist nicht mit dem Klonen zu verwechseln, dessen Ziel in der Herstellung genetisch identischer Organismen besteht. Wie besprechen ein Anwendungsbeispiel der Klonierung, die Insulinherstellung in der pharmazeutischen Industrie. Hierbei wird ein menschliches Insulingen auf ein Bakterium übertragen, meist das Darmbakterium E-coli. Das Bakterium, das nun das menschliche Insulingen aufweist, produziert Insulin. Dieses Insulin wird als Medikament verwendet und kann Diabetespatienten verabreicht werden. Früher wurde das Insulin aus Schweinen gewonnen. Die moderne Gentechnik hat diese Methode ersetzt. Wir besprechen diese Methode jetzt Schritt für Schritt. Als erstes wird eine DNA-Isolation durchgeführt. Aus dem Bakterium wird ein ringförmiges DNA-Molekül isoliert, das als Plasmid bezeichnet wird. Es dient als Vektor. Wir gehen später näher darauf ein. Außerdem muss ein menschliches Insulingen isoliert werden. Doch das isolierte menschliche Gen kann nicht einfach sofort in das Plasmid eingebaut werden. Bei der Übertragung eines Gens von einer eukaryotischen Zelle, zum Beispiel einer menschlichen Zelle, auf eine prokaryotische Zelle, in der Regel ein Bakterium, muss Folgendes beachtet werden. Gucken wir uns ein eukaryotisches Gen genauer an. Dies soll einen DNA-Doppelstrang darstellen. Ein eukaryotisches Gen ist in Exons und Introns gegliedert. Die Exons, hier rot dargestellt, sind die codierende Abschnitte des Gens. Die Introns, hier gelb dargestellt, sind die nicht codierenden Abschnitte. Im Gegensatz dazu weisen bakterielle Gene keine Introns auf. Daher haben Bakterien keine Enzyme zum Herausschneiden dieser Introns. Würde man das intronhaltige Gen in eine Bakterienzelle einbauen, würden wir daher nicht das gewünschte Protein erhalten. Wir brauchen also DNA ohne die Introns. Man stellt deshalb die sogenannte cDNA her. Diese enthält keine Introns. Gehen wir näher auf die Herstellung von cDNA ein. Am Anfang haben wir unsere DNA, die Exons und Introns enthält. Bei der Transkription wird zuerst die prä-mRNA hergestellt. Dieser prä-mRNA-Einzelstrang enthält noch Introns. Danach erfolgt das Spleißen. Hierbei werden die Introns herausgeschnitten. Wir erhalten die reife mRNA. Nun führt der Forscher die sogenannte reverse Transkription durch. Es wird ein DNA-Molekül hergestellt, das komplementär zur mRNA ist. Deshalb heißt die cDNA complementary DNA, englisch für komplementäre DNA. Bei einem zweiten Schritt wird die DNA zu einem Doppelstrang ergänzt. Wir erhalten somit doppelsträngige cDNA, die nur Exons und keine Introns aufweist. Nun kann der Geneinbau in ein Plasmid erfolgen. Zur kurzen Wiederholung: Ein Plasmid ist ein ringförmiges DNA-Molekül, das in Bakterien neben dem Chromosom vorliegt und sich autonom replizieren kann. Es wird als Vektor verwendet, also als Genfähre oder Gentaxi. Ein Vektor dienst also zur Übertragung von DNA. Bevor der Einbau durchgeführt werden kann, muss erst die Restriktionen durchgeführt werden. Wir nehmen also unser ausgewähltes Gen, das Insulingen, und ein Plasmid. Der orangene Bereich ist ein Resistenzgen, wir gehen später genauer darauf ein. Die beiden DNA-Moleküle werden an den sogenannten Restriktionsschnittstellen geschnitten. Das sind spezifische Basenabfolgen, die durch bestimmte Restriktionsenzyme zerschnitten werden. Es ist wichtig, dass die Restriktion mit dem gleichen Restriktionsenzym durchgeführt wird. Dadurch entstehen am Gen und am Plasmid die gleichen klebrigen Enden. Das heißt, die einzelsträngigen DNA-Bereiche an den jeweiligen Schnittstellen sind komplementär zueinander. Das ermöglicht einen Einbau des Gens in das Plasmid. Als Nächstes erfolgt die Ligation mit dem Enzym Ligase. Diese klebt die DNA zusammen, genauer gesagt verbindet sie die 3’- und 5’-Enden Phosphat-Zucker-Rückgrats der DNA. Wir erhalten rekombinante DNA. Nun kann der Transfer des Plasmids in die Bakterienzelle erfolgen. Das heißt, das Plasmid wird entweder mithilfe von elektrischen Impulsen oder mithilfe von Chemikalien in ein Bakterium eingeschleust. Doch nicht in jeder der Bakterienzellen wird das Plasmid erfolgreich eingeschleust. Manche Bakterien weisen kein Plasmid auf. Es muss daher eine Selektion der Bakterien erfolgen, die das Plasmid tragen. Die Selektion wird folgenderweise durchgeführt: Die Bakterien wachsen einem Medium heran, das mit einem Antibiotikum versetzt wurde. Die Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben, weisen somit auch ein Resistenzgen auf, das sich auf dem Plasmid befindet. Die Bakterien sind gegen das Antibiotikum resistent. Das heißt, Bakterien mit Plasmid wachsen in diesem Medium. Bakterien ohne Plasmid sterben hingegen. In den Bakterienkolonien, die wachsen, ist also das Plasmid enthalten. Diese Bakterien können nun für die Insulinherstellung verwendet werden. Die Bakterien, die alle das Plasmid tragen, vermehren sich durch Zweiteilung und bilden somit identische Klone. Es kommt somit zur identischen Vervielfachung des eingebauten Insulingens. Dieses Gen wird exprimiert. Das heißt, es findet Proteinbiosynthese statt und das Protein Insulin wird von den Bakterien hergestellt. Diese Genexpression findet innerhalb der Bakterienzellen statt. Um reines Insulin zu gewinnen, müssen die Bakterien aufgebrochen werden und das Insulin muss mit einer bestimmten Methode von den anderen Substanzen getrennt werden. Das Insulin wird aufgereinigt und wird als Medikament verwendet. Wir kommen zur Zusammenfassung: Als erstes erfolgt die DNA-Isolation. Aus dem Bakterium wird ein Plasmid isoliert. Aus dem Menschen wird ein gewünschtes Gen isoliert. Da dieses noch Introns trägt, muss es zuerst in cDNA übersetzt werden. Als Nächstes erfolgt die Restriktionen mithilfe von den gleichen Restriktionsenzymen. Als Nächstes erfolgt die Ligation. Das heißt, die Plasmid-DNA und das gewünschte Gen werden zusammengefügt. Danach kann der Transfer des Plasmids in die Bakterienzelle erfolgen. Nun muss noch festgestellt werden, welche Zellen das Plasmid eingebaut haben. Hierfür wird die Selektion mithilfe eines Antibiotikums durchgeführt. Danke für deine Aufmerksamkeit. Tschüss! Bis zum nächsten Video.

5 Kommentare
  1. Default

    Danke sehr, hat mir sehr geholfen

    Von Doaa Sada, vor 2 Monaten
  2. Default

    Super Video ! Hat mir sehr geholfen

    Von Freestyla1998, vor fast 3 Jahren
  3. Default

    Prima Video. Sehr einfach erklärt. Vielen Dank

    Von Jaydentyler8, vor mehr als 3 Jahren
  4. Default

    Hat mir sehr geholfen!!

    Von Jenny A., vor etwa 4 Jahren
  5. Default

    wirklich klasse Video!

    Von Annalaurap, vor fast 5 Jahren