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Klonierung – Angewandte Gentechnik 11:54 min

Textversion des Videos

Transkript Klonierung – Angewandte Gentechnik

Hallo! Willkommen zum Video “Angewandte Gentechnik – Klonierung”. In diesem Video beantworten wir die Frage: Was ist Klonierung und wie wird diese durchgeführt? Als konkretes Anwendungsbeispiel besprechen wir die Insulinherstellung. Wir gehen näher auf die molekularbiologische Methode der Klonierung mit Hilfe bakterieller Plasmide ein. Damit du dieses Video optimal verstehst, solltest du folgendes Vorwissen aufweisen: Du bist ja bereits mit dem Grundlagen der Gentechnik vertraut. Du weißt, was Eukaryoten und Prokaryoten sind und wie sich diese unterscheiden. Du solltest schon was von Restriktionsenzym gehört haben und wissen, wie diese molekularen Scheren funktionieren. Es ist wichtig, dass du das Grundprinzip der Proteinbiosynthese verstanden hast, also den Weg vom Gen zum Protein. Was ist also Klonierung? Klonierung ist in der Molekularbiologie der Überbegriff für Methoden zur Gewinnung und identischen Vervielfachung von DNA. Achtung! Der Begriff ist nicht mit dem Klonen zu verwechseln, dessen Ziel in der Herstellung genetisch identischer Organismen besteht. Wie besprechen ein Anwendungsbeispiel der Klonierung, die Insulinherstellung in der pharmazeutischen Industrie. Hierbei wird ein menschliches Insulingen auf ein Bakterium übertragen, meist das Darmbakterium E-coli. Das Bakterium, das nun das menschliche Insulingen aufweist, produziert Insulin. Dieses Insulin wird als Medikament verwendet und kann Diabetespatienten verabreicht werden. Früher wurde das Insulin aus Schweinen gewonnen. Die moderne Gentechnik hat diese Methode ersetzt. Wir besprechen diese Methode jetzt Schritt für Schritt. Als erstes wird eine DNA-Isolation durchgeführt. Aus dem Bakterium wird ein ringförmiges DNA-Molekül isoliert, das als Plasmid bezeichnet wird. Es dient als Vektor. Wir gehen später näher darauf ein. Außerdem muss ein menschliches Insulingen isoliert werden. Doch das isolierte menschliche Gen kann nicht einfach sofort in das Plasmid eingebaut werden. Bei der Übertragung eines Gens von einer eukaryotischen Zelle, zum Beispiel einer menschlichen Zelle, auf eine prokaryotische Zelle, in der Regel ein Bakterium, muss Folgendes beachtet werden. Gucken wir uns ein eukaryotisches Gen genauer an. Dies soll einen DNA-Doppelstrang darstellen. Ein eukaryotisches Gen ist in Exons und Introns gegliedert. Die Exons, hier rot dargestellt, sind die codierende Abschnitte des Gens. Die Introns, hier gelb dargestellt, sind die nicht codierenden Abschnitte. Im Gegensatz dazu weisen bakterielle Gene keine Introns auf. Daher haben Bakterien keine Enzyme zum Herausschneiden dieser Introns. Würde man das intronhaltige Gen in eine Bakterienzelle einbauen, würden wir daher nicht das gewünschte Protein erhalten. Wir brauchen also DNA ohne die Introns. Man stellt deshalb die sogenannte cDNA her. Diese enthält keine Introns. Gehen wir näher auf die Herstellung von cDNA ein. Am Anfang haben wir unsere DNA, die Exons und Introns enthält. Bei der Transkription wird zuerst die prä-mRNA hergestellt. Dieser prä-mRNA-Einzelstrang enthält noch Introns. Danach erfolgt das Spleißen. Hierbei werden die Introns herausgeschnitten. Wir erhalten die reife mRNA. Nun führt der Forscher die sogenannte reverse Transkription durch. Es wird ein DNA-Molekül hergestellt, das komplementär zur mRNA ist. Deshalb heißt die cDNA complementary DNA, englisch für komplementäre DNA. Bei einem zweiten Schritt wird die DNA zu einem Doppelstrang ergänzt. Wir erhalten somit doppelsträngige cDNA, die nur Exons und keine Introns aufweist. Nun kann der Geneinbau in ein Plasmid erfolgen. Zur kurzen Wiederholung: Ein Plasmid ist ein ringförmiges DNA-Molekül, das in Bakterien neben dem Chromosom vorliegt und sich autonom replizieren kann. Es wird als Vektor verwendet, also als Genfähre oder Gentaxi. Ein Vektor dienst also zur Übertragung von DNA. Bevor der Einbau durchgeführt werden kann, muss erst die Restriktionen durchgeführt werden. Wir nehmen also unser ausgewähltes Gen, das Insulingen, und ein Plasmid. Der orangene Bereich ist ein Resistenzgen, wir gehen später genauer darauf ein. Die beiden DNA-Moleküle werden an den sogenannten Restriktionsschnittstellen geschnitten. Das sind spezifische Basenabfolgen, die durch bestimmte Restriktionsenzyme zerschnitten werden. Es ist wichtig, dass die Restriktion mit dem gleichen Restriktionsenzym durchgeführt wird. Dadurch entstehen am Gen und am Plasmid die gleichen klebrigen Enden. Das heißt, die einzelsträngigen DNA-Bereiche an den jeweiligen Schnittstellen sind komplementär zueinander. Das ermöglicht einen Einbau des Gens in das Plasmid. Als Nächstes erfolgt die Ligation mit dem Enzym Ligase. Diese klebt die DNA zusammen, genauer gesagt verbindet sie die 3’- und 5’-Enden Phosphat-Zucker-Rückgrats der DNA. Wir erhalten rekombinante DNA. Nun kann der Transfer des Plasmids in die Bakterienzelle erfolgen. Das heißt, das Plasmid wird entweder mithilfe von elektrischen Impulsen oder mithilfe von Chemikalien in ein Bakterium eingeschleust. Doch nicht in jeder der Bakterienzellen wird das Plasmid erfolgreich eingeschleust. Manche Bakterien weisen kein Plasmid auf. Es muss daher eine Selektion der Bakterien erfolgen, die das Plasmid tragen. Die Selektion wird folgenderweise durchgeführt: Die Bakterien wachsen einem Medium heran, das mit einem Antibiotikum versetzt wurde. Die Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben, weisen somit auch ein Resistenzgen auf, das sich auf dem Plasmid befindet. Die Bakterien sind gegen das Antibiotikum resistent. Das heißt, Bakterien mit Plasmid wachsen in diesem Medium. Bakterien ohne Plasmid sterben hingegen. In den Bakterienkolonien, die wachsen, ist also das Plasmid enthalten. Diese Bakterien können nun für die Insulinherstellung verwendet werden. Die Bakterien, die alle das Plasmid tragen, vermehren sich durch Zweiteilung und bilden somit identische Klone. Es kommt somit zur identischen Vervielfachung des eingebauten Insulingens. Dieses Gen wird exprimiert. Das heißt, es findet Proteinbiosynthese statt und das Protein Insulin wird von den Bakterien hergestellt. Diese Genexpression findet innerhalb der Bakterienzellen statt. Um reines Insulin zu gewinnen, müssen die Bakterien aufgebrochen werden und das Insulin muss mit einer bestimmten Methode von den anderen Substanzen getrennt werden. Das Insulin wird aufgereinigt und wird als Medikament verwendet. Wir kommen zur Zusammenfassung: Als erstes erfolgt die DNA-Isolation. Aus dem Bakterium wird ein Plasmid isoliert. Aus dem Menschen wird ein gewünschtes Gen isoliert. Da dieses noch Introns trägt, muss es zuerst in cDNA übersetzt werden. Als Nächstes erfolgt die Restriktionen mithilfe von den gleichen Restriktionsenzymen. Als Nächstes erfolgt die Ligation. Das heißt, die Plasmid-DNA und das gewünschte Gen werden zusammengefügt. Danach kann der Transfer des Plasmids in die Bakterienzelle erfolgen. Nun muss noch festgestellt werden, welche Zellen das Plasmid eingebaut haben. Hierfür wird die Selektion mithilfe eines Antibiotikums durchgeführt. Danke für deine Aufmerksamkeit. Tschüss! Bis zum nächsten Video.

5 Kommentare
  1. Danke sehr, hat mir sehr geholfen

    Von Doaa Sada, vor 11 Monaten
  2. Super Video ! Hat mir sehr geholfen

    Von Freestyla1998, vor mehr als 3 Jahren
  3. Prima Video. Sehr einfach erklärt. Vielen Dank

    Von Jaydentyler8, vor mehr als 4 Jahren
  4. Hat mir sehr geholfen!!

    Von Jenny A., vor mehr als 4 Jahren
  5. wirklich klasse Video!

    Von Annalaurap, vor mehr als 5 Jahren

Klonierung – Angewandte Gentechnik Übung

Du möchtest dein gelerntes Wissen anwenden? Mit den Aufgaben zum Video Klonierung – Angewandte Gentechnik kannst du es wiederholen und üben.

  • Erkläre, was man in der Molekularbiologie unter Klonierung versteht.

    Tipps

    Erinnere dich, wie ein Plasmid aufgebaut ist und welche Eigenschaften es dem Bakterium verleiht, wenn es das Plasmid aufgenommen hat.

    Lösung

    Die Klonierung dient vor allem der Gewinnung und Vervielfältigung bestimmter DNA-Fragmente, wie beispielsweise dem Gen für Insulin.

    Das gewünschte Gen wird, unter Verwendung von Restriktionsenzymen, in ein bakterielles Plasmid eingebracht. Das Plasmid wiederum wird zurück in eine Bakterienzelle transferiert. Um die Membran der Bakterien kurzfristig porös zu machen, werden sie mit Chemikalien oder elektrischen Impulsen behandelt. So kann das Plasmid von der Bakterienzelle aufgenommen werden.

    Für die Selektion derjenigen Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben, dient ein Nährmedium, das mit einem Antibiotikum versetzt wurde.

    Da sich auf dem Plasmid nicht nur das gewünschte Gen, sondern auch ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum befindet, sind alle Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben, resistent. Diese Bakterien wachsen auf dem Medium.

    Wenn die Bakterien sich teilen, entstehen immer mehr Bakterien, die das Gen tragen und somit auch Insulin produzieren. Haben sich die Bakterien ausreichend vermehrt, werden sie so behandelt, dass das Insulin aus ihnen gewonnen werden kann.

  • Erkläre, wie aus genomischer DNA cDNA hergestellt werden kann.

    Tipps

    Was ist der Unterschied zwischen der prä-mRNA und der reifen mRNA?

    Die cDNA enthält keine Introns.

    Lösung

    Im ersten Schritt wird die genomische DNA transkribiert. Es entsteht prä-mRNA. Diese enthält sowohl Exons als auch Introns. Im nächsten Schritt wird die prä-mRNA gespleißt, sodass nur noch die codierenden Bereiche, also die Exons, übrig bleiben. Das ist die reife mRNA. Diese mRNA wird nun für die reverse Transkription genutzt und mithilfe des Enzyms „reverse Transkriptase“ zu cDNA umgeschrieben.

    Die cDNA kann dann in einem Plasmid kloniert werden.

  • Benenne die Teilschritte des Klonierungsprozesses bei der Insulingewinnung.

    Tipps

    Überlege, was passieren muss, bevor ein eukaryotisches Gen in einen prokaryotischen Organismus gebracht wird und wie sich der Aufbau der DNA unterscheidet.

    Lösung

    Los geht es mit der DNA-Isolation. Das Plasmid muss aus dem Bakterium und das Insulingen aus dem Menschen gewonnen werden.

    Da das eukaryotische Gen des Menschen auch Introns enthält, muss das Gen in cDNA umgeschrieben werden. Bei der Transkription wird das Gen in mRNA umgeschrieben. Diese enthält keine Introns mehr. Mit Hilfe des Enzyms „Reverse Transkriptase" wird die mRNA in cDNA übersetzt.

    Im folgenden Schritt müssen beide DNAs, das Plasmid und die cDNA des Insulingens mit dem gleichen Restriktionsenzymen geschnitten werden. Diesen Vorgang nennt man Restriktion.

    Das Enzym Ligase sorgt nun dafür, dass die cDNA im Plasmid verbleibt. Sie "klebt" das Gen sozusagen in das Plasmid. Dieser Prozess heißt Ligation.

    Das fertige Plasmid enthält nun das Gen für Insulin und ein Gen für Antibiotikasresistenz.

    Das Plasmid muss nun wieder in Bakterien eingebracht werden, damit diese das Insulin produzieren können. Hierzu werden die Bakterien mit Chemikalien oder elektrischen Impulsen behandelt.

    Welche Bakterien das Plasmid aufgenommen haben, wird mithilfe eines mit einem Antibiotikum versetzten Mediums festgestellt. Auf diesem Medium überleben nur diejenigen Bakterien, die das Plasmid aufgenommen haben und somit das Resistenzgen tragen.

  • Zeige auf, welche Replikationsenzyme für die Klonierung geeignet sind.

    Tipps

    Gehe die einzelnen Enzyme der Reihe nach durch und überlege, welche du ausschließen kannst.

    Überlege, wo auf keinen Fall geschnitten werden darf.

    Lösung

    Gehen wir die Enzyme der Reihe nach durch:

    XbaI: Insulingen: XbaI schneidet außerhalb des Gens und ist somit für das Insulingen geeignet. Es schneidet aber auch innerhalb des Resistenzgens. Würde man also das Plasmid mit XbaI schneiden, würde sich das Insulingen zwischen die beiden XbaI-Schnittstellen setzen. Somit würde ein Teil des Resistenzgens fehlen und es würde nicht mehr funktionieren.

    SmaI: SmaI schneidet außerhalb des Insulingens und ist somit für diese DNA geeignet. SamI hat auch eine Schnittstelle im Plasmid. Dort kann das Enzym den Ring aufschneiden und das Insulingen kann eingefügt werden. SmaI würde somit funktionieren.

    EcoRI: EcoRI schneidet ebenfalls außerhalb des Insulingens und wäre somit für diese DNA geeignet. Im Plasmid schneidet EcoRI aber an zwei Stellen, wovon eine innerhalb des Startpunktes für die Replikation liegt. Würde sich das Insulingen dort in den Ring setzten, wäre der Startpunkt zerstört und das Plasmid könnte nicht mehr repliziert, also vermehrt werden.

    PstI: PstI hat eine gut geeignete Schnittstelle innerhalb des Plasmids. Allerdings schneidet PstI innerhalb des Insulingens, sodass dieses zerstört werden würde.

    SmaI ist demnach das einzige Enzym, dass für die Klonierung verwendet werden kann.

  • Gib an, welche Aussagen zur Klonierung richtig sind.

    Tipps

    Überlege, bei welchem Vorgang mRNA entsteht und was sie von DNA unterscheidet.

    Bakterien besitzen keine Enzyme für das Spleißen.

    Lösung

    Für Klonierungen wird immer cDNA verwendet, da nur DNA repliziert, also vom Bakterium vervielfältigt werden kann. mRNA entsteht bei der Transkription. Zwar haben sowohl cDNA als auch RNA keine Introns mehr, mRNA-Moleküle können aber nicht repliziert werden und sind somit unbrauchbar für Klonierungen. Die genomische DNA enthält hingegen Introns. Da bakterielle DNA jedoch keine Introns enthält, besitzen Bakterien auch keine Enzyme, um DNA zu spleißen.

    mRNA und genomische DNA sind daher ungeeignet für Klonierungen.

    Möchte man nun ein Gen in ein Plasmid einbringen, ist es wichtig, dass beide DNAs (Plasmid und Gen) mit demselben Restriktionsenzym geschnitten werden. Würde man unterschiedliche Enzyme verwenden, würden die entstandenen Enden nicht zusammenpassen und eine Ligation könnte nicht stattfinden.

    Bakterien dienen bei der Klonierung der Vervielfältigung der DNA. Jeder Teilung eines Bakterium geht eine Replikation der DNA, also auch des Plasmids, voraus. Da sich Bakterien so schnell teilen, eignen sie sich besonders gut für Klonierungen.

    DNA ist universell. Das bedeutet, dass jede DNA, egal aus welchem Lebewesen sie stammt, von einem anderen Lebewesen gelesen und auch in Proteine übersetzt werden kann. Bakterien vervielfältigen daher nicht nur das eingeschleuste Gen, sondern produzieren auch das entsprechende Protein, zum Beispiel Insulin.

  • Stelle dar, um welche Klonierungsschritte es sich handelt.

    Tipps

    Überlege, welche Enzyme nur an spezifischen Erkennungssequenzen wirken.

    Erinnere dich, wo sich die DNA bei Bakterien und eukaryotischen Zellen befindet und überlege, was man machen muss, um an die DNA zu gelangen.

    Lösung

    Um DNA aus Bakterien oder eukaryotischen Zellen zu isolieren, muss die Zellmembran, und bei den eukaryotischen Zellen auch die Kernmembran, komplett zerstört werden. Nur so kommt man an die aufgereinigte DNA.

    Für die Restriktion benötigt man Restriktionsenzyme. Jedes Restriktionsenzym hat eine spezifische Erkennungssequenz. Zum Beispiel erkennt das Enzym EcoRI aus dem Darmbakterium E.coli die Sequenz GAATTC. Demnach müssen die entsprechenden Sequenzen sowohl im Plasmid als auch im DNA-Fragment zu finden sein.

    Wurden beide DNAs geschnitten und das Fragment in den Vektor eingebaut, müssen die Schnittstellen noch verklebt werden. Das macht das Enzym Ligase. Die Ligase kennst du schon von der Replikation. Dort ist sie für das Zusammenkleben der Okazaki-Fragmente verantwortlich.

    Der Transfer des fertigen Plasmids in eine Bakterienzelle wird auch als Transformation bezeichnet. Wie du im Video gelernt hast, werden die Bakterien hierfür mit Chemikalien oder elektrischen Impulsen bearbeitet. Diese Verfahren machen die Membran der Bakterien porös und löchrig, sodass die Plasmide aufgenommen werden können. Führt man diese Behandlungen aber zu lange durch, sterben die Bakterien ab, da sie ihre Membran dann nicht mehr reparieren können.

    Der letzte wichtige Schritt bei der Klonierung ist die Selektion. Mithilfe von Antibiotika filtert man diejenigen Bakterien heraus, die das Plasmid aufgenommen haben. Alle anderen sterben, da sie nicht resistent gegen das Antibiotikum sind. Würde man diese Selektion nicht durchführen, würden sich alle Bakterien, mit oder ohne Plasmid, vermehren. So würde zwar in kurzer Zeit eine große Masse an Bakterien entstehen, die Ausbeute an dem gewünschten Genprodukt wäre aber viel geringer.