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PCR – Vervielfältigung von DNA 03:26 min

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Transkript PCR – Vervielfältigung von DNA

Hallo! Ich werde euch heute die Polymerase-Kettenreaktion oder auch einfach PCR-Methode erklären. Dazu müsst ihr schon wissen, wie die DNA aufgebaut ist und wie die DNA-Replikation funktioniert. Die Polymerase-Kettenreaktion dient der Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Abschnittes und wird zum Beispiel gebraucht, wenn man eine DNA-Analyse durchführen will und nicht genügend DNA vorhanden ist. Sie beruht auf einem sich wiederholenden dreiteiligen Zyklus, der sich aus der Denaturierung, der Hybridisierung und der Polymerisation zusammensetzt. Bei der Denaturierung wird die Ausgangs-DNA bei 94 °C vom DNA-Doppelstrang in 2 komplementäre DNA-Einzelstränge getrennt. Die DNA denaturiert bei dieser hohen Temperatur. Beim nächsten Schritt, der Hybridisierung, wird die Temperatur auf 55 °C gesenkt. Hier siehst du die Basensequenz des Leit- und Folgestrangs der Denaturierung. Nun werden Primer hinzugegeben. Das sind künstlich hergestellte Nukleotidsequenzen. Sie binden an die Anfangsstelle des DNA-Abschnittes, das 3'-Ende. Die Voraussetzung dafür ist, dass man die Basensequenz des Abschnittes bereits kennt, damit die Primer auch wirklich aus den komplementären Basen des Stranganfangs bestehen. Die gebundenen Primer dienen nun als Ansatzstelle für die zugeführten Polymerasen. Nun zum letzten Schritt, der Polymerisation: Wie ihr bereits aus der DNA-Replikation wisst, verknüpfen Polymerasen die Nukleotide, die über die komplementären Basen an den Einzelstrang anlagern. Bei der PCR-Methode ist die Polymerase eine hitzestabile Taq-Polymerase. Taq-Polymerasen kommen aus Bakterien, die in heißen Quellen leben. Polymerasen haben bei 72 °C ihre ideale Arbeitstemperatur, überstehen aber auch höhere Temperaturen wie zum Beispiel die 94 °C in der ersten Phase. Deshalb ist die Taq-Polymerase gut geeignet. Eine andere DNA-Polymerase würde in der ersten Phase zerstört werden und müsste bei jeder Wiederholung des Zyklus neu hinzugegeben werden. Bei der Polymerisation binden also die Taq-Polymerasen mithilfe der Primer an die DNA-Einzelstränge und verknüpfen die restlichen Nukleotide an die komplementären Abschnitte der DNA-Stränge. Am Ende dieses Zyklus sind nun 2 DNA-Doppelstränge des DNA-Abschnittes vorhanden. Durch ständige Wiederholung dieser 3 Schritte wird mit jedem Zyklus die Anzahl der DNA-Doppelstränge erhöht. Dabei wird immer aus jedem DNA-Einzelstrang ein neuer DNA-Doppelstrang. Somit lassen sich winzige Mengen an DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion in kürzester Zeit sehr schnell vervielfältigen. Der Begriff Kettenreaktion beschreibt, dass für jeden Zyklus auch die Produkte des vorherigen Zyklus als Vorlage dienen. So, in diesem Film hast du gelernt, wie man durch die PCR-Methode, die aus Denaturierung, Hybridisierung und Polymerisation besteht, die DNA vervielfachen kann. Das war es für heute.

7 Kommentare
  1. Hallo Elmar Schwidde,
    da hast du natürlich recht! Vielen Dank für den Hinweis!
    Ich habe es soeben korrigiert.
    Beste Grüße aus der Redaktion

    Von Tatjana Elbing, vor mehr als einem Jahr
  2. Es muss in der ersten Übung auch Hybridisierung heißen, statt Hybritisierung.

    Von Elmar Schwidde, vor mehr als einem Jahr
  3. Hallo, wie und wo finde ich Arbeitsblätter mit Übungen zu diesem Thema?

    Von Daniela Gatza, vor mehr als 2 Jahren
  4. Hallo Lena,
    du hast vollkommen recht. Man spricht bei der Denaturierung davon, dass die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den DNA-Strängen aufgebrochen werden und so die DNA-Doppelstränge zu Einzelsträngen aufgetrennt werden.

    Von Serpil K., vor fast 5 Jahren
  5. Ich bin mir nicht ganz sicher, aber die DNA an sich denaturiert doch nicht. Sind es nicht eher die Wasserstoffbrückenbindungen?

    Von Lena Pfannebecker, vor fast 5 Jahren
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PCR – Vervielfältigung von DNA Übung

Du möchtest dein gelerntes Wissen anwenden? Mit den Aufgaben zum Video PCR – Vervielfältigung von DNA kannst du es wiederholen und üben.

  • Benenne die Schritte der Polymerase-Kettenreaktion.

    Tipps

    72 °C ist die ideale Arbeitstemperatur der bakterienstämmigen Polymerase, welche bei der PCR genutzt wird.

    Ein anderer Begriff für den Schritt Hybridisierung ist Anlagerung. Was wird dabei wo angelagert?

    Lösung

    $\begin{array}{l|c|c|c} \textbf{Bezeichnung}&Denaturierung&Hybridisierung&Polymerisation\\ \hline \textbf{Temperatur}&etwa~94~°C&55-65~°C&etwa~72~°C\\ \hline \textbf{Ausgangsmaterial}&DNA-Doppelstränge&DNA-Einzelstränge&DNA-Einzelstränge\\ \hline \textbf{Weitere~Substanzen}&keine&Primer&Taq-Polymerase\\ \end{array}$

  • Beschreibe den Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion.

    Tipps

    Am Anfang und Ende jedes PCR-Zyklus steht doppelsträngige DNA. Dazwischen liegt sie in Einzelsträngen vor.

    Lösung

    Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion:

    1. Die Probe mit der DNA-Zielsequenz wird auf etwa 94 °C erhitzt, woraufhin der DNA-Doppelstrang denaturiert und in seine Einzelstränge zerfällt.
    2. Die Temperatur wird auf 55–65 °C herunter gekühlt, während synthetisch hergestellte Primer an die DNA-Einzelstränge binden.
    3. Bei etwa 72 °C nutzen Taq-Polymerasen die Primer als Startpunkte und synthetisieren komplementäre DNA-Stränge.
    4. Doppelsträngige DNA entsteht. Die Anzahl an DNA-Fragmenten hat sich verdoppelt.
    5. Der Zyklus – bestehend aus Denaturierung, Hybridisierung und Polymerisation – kann nun erneut stattfinden, bis die replizierte DNA für nachfolgende Tests oder zur Profilerstellung ausreichend vorhanden ist.
  • Stelle sowohl den Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion detailliert in einem Zyklus als auch die vervielfältigte DNA nach drei Zyklen dar.

    Tipps

    Die drei Schritte der Polymerase-Kettenreaktion werden solange wiederholt, bis genügend DNA vorhanden ist. Es werden meist etwa 20–50 Zyklen durchgeführt.

    Ausgehend vom DNA-Primer vervollständigt die Taq-Polymerase die DNA-Einzelstränge zu DNA-Doppelsträngen.

    Lösung

    Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion

    Die PCR erfolgt in den folgenden drei Schritten:
    1 – Den: Denaturierung
    2 – Hyb: Hybridisierung
    3 – Poly: Polymerisation

    Diese werden in Zyklen wiederholt, bis genügend DNA vorhanden ist:
    Zyklus 1: der erste Zyklus
    Zyklus 2: der zweite Zyklus
    Zyklus 3: der dritte Zyklus

    Für einen PCR-Vorgang benötigt man zusätzlich:
    Primer: DNA-Primer
    Nuk: Nukleotide
    Taq-P: Taq-Polymerase

    So wird aus wenig
    A-DNA: Ausgangs-DNA (eine DNA-Probe)
    viel identische
    S-DNA: synthetisierte DNA.

  • Begründe die Wichtigkeit der Temperatur während der Hybridisierung anhand eines spezifischen Primers.

    Tipps

    Die Anlagerungs- und Schmelztemperaturen von Primern unterscheiden sich um ca. 3 °C.

    Bei zu hohen Temperaturen schmilzt DNA, so auch die, aus der Primer bei der PCR bestehen. Dieser Vorgang äußert sich im Zerbrechen der Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen.

    Lösung

    Richtige Temperatur
    Die optimale Anlagerungstemperatur liegt meist etwa 3 °C unterhalb der Schmelztemperatur des Primers, in diesem Fall also bei 60 °C. Diese Temperatur erlaubt die Hybridisierung zwischen Primer und DNA-Zielsequenz und verhindert gleichzeitig die Bildung fehlerhafter Bindungen.

    Zu niedrige Temperatur
    Ist die Anlagerungstemperatur zu niedrig, in diesem Fall 55 °C, kommt es möglicherweise zu fehlerhaften Bindungen zwischen Primer und DNA-Zielsequenz. Der Primer bildet hierbei eine lockere Bindung zu weniger homologen Bereichen der Zielsequenz. Dieser Vorgang heißt auch Fehlpriming und führt zu unerwünschten Produkten, die nicht mit der Zielsequenz übereinstimmen.

    Zu hohe Temperatur
    Steigende Temperaturen brechen solche Verbindungen auf, weil ihre Bindungsenergie nicht groß genug ist. Nur die maximale Übereinstimmung der Basenpaarung hat eine hohe Bindungsstärke zur Folge. Wird die Temperatur zu hoch, in diesem Fall 63 °C, kann selbst zwischen homologen Sequenzen keine Bindung entstehen, weil die Schmelztemperatur des Primers erreicht wird.

  • Definiere einige Grundbegriffe der Polymerase-Kettenreaktion.

    Tipps

    Die Polymerase-Kettenreaktion wird immer dann genutzt, wenn nicht genügend DNA für eine DNA-Analyse vorhanden ist.

    Das Bakterium Thermus aquaticus (Abkürzung: Taq) lebt in Geysiren bei circa 70 °C.

    Lösung

    Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist die Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Abschnitts vor einer DNA-Analyse.
    Ein PCR-Zyklus besteht aus den Schritten Denaturierung, Hybridisierung und Polymerisation. Dieser Zyklus wird so oft wiederholt, bis genügend DNA-Material vorhanden ist.

    Bei dem ersten Schritt, der Denaturierung, wird der DNA-Doppelstrang durch Hitze in seine beiden Einzelstränge aufgebrochen.
    Bei der folgenden Hybridisierung bilden synthetisch hergestellte Nukleotidsequenzen, die Primer, die Ansatzstelle für Polymerasen.
    Beim letzten Schritt der PCR, der Polymerisation, wird die hitzestabile Taq-Polymerase verwendet, welche aus Bakterien gewonnen wird.

  • Begründe die Nutzung verschiedener DNA-Polymerasen bei der PCR.

    Tipps

    Escherichia coli kommt unter anderem im menschlichen Darm vor. Welche Temperatur herrscht in unseren Eingeweiden?

    Die DNA-Polymerasen von Mikroorganismen werden häufig nach deren Artnamen benannt:

    Betrachte Thermus aquaticus und Pyrococcus furiosus etwas genauer.

    Lösung

    Die PCR wurde 1983 von Kary Mullis erfunden. Er nutzte zunächst das Enzym DNA-Polymerase I von E. coli, einem mesophilen Bakterium mit einem Temperaturoptimum von etwa 39 °C. Bei der Erhitzung der DNA denaturiert das Enzym und muss folglich bei jedem Zyklus neu hinzugegeben werden. Dadurch war die ursprüngliche PCR ein recht aufwändiger und ineffizienter Vorgang.

    Mittlerweile wird bei der PCR häufig die Taq-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium T. aquaticus verwendet, die ein Optimum von etwa 72 °C aufweist und auch höhere Temperaturen übersteht. Die Verwendung von DNA-Polymerasen aus wärmeliebenden Bakterien hat die PCR-Technologie deutlich verbessert und automatisiert.

    Taq-Polymerase ist günstig und schnell; allerdings produziert sie manchmal Fehler beim Kopieren, wodurch Mutationen in der DNA-Sequenz entstehen können. Werden sequenzexakte DNA-Klone benötigt, kann die aus dem thermophilen Archaebakterium Pyrococcus furiosus isolierte Pfu-Polymerase angewendet werden. Sie besitzt eine Korrekturlesefunktion.

    Während der Synthese des neuen DNA-Strangs in 5‘-3‘-Richtung, wird dieser fortlaufend in 3‘-5‘-Richtung auf Fehlpaarungen untersucht. Detektiert die Polymerase einen Fehler, wird dieser ausgebaut und durch das korrekte Nukleotid ersetzt. Dadurch ist die PCR langsamer aber genauer.