PCR – Vervielfältigung von DNA

PCR – Vervielfältigung von DNA Übung

• Benenne die Schritte der Polymerase-Kettenreaktion.

  Tipps

  72 °C ist die ideale Arbeitstemperatur der bakterienstämmigen Polymerase, welche bei der PCR genutzt wird.

  Ein anderer Begriff für den Schritt Hybridisierung ist Anlagerung. Was wird dabei wo angelagert?

  Lösung

  $\begin{array}{l|c|c|c} \textbf{Bezeichnung}&Denaturierung&Hybridisierung&Polymerisation\\ \hline \textbf{Temperatur}&etwa~94~°C&55-65~°C&etwa~72~°C\\ \hline \textbf{Ausgangsmaterial}&DNA-Doppelstränge&DNA-Einzelstränge&DNA-Einzelstränge\\ \hline \textbf{Weitere~Substanzen}&keine&Primer&Taq-Polymerase\\ \end{array}$

• Beschreibe den Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion.

  Tipps

  Am Anfang und Ende jedes PCR-Zyklus steht doppelsträngige DNA. Dazwischen liegt sie in Einzelsträngen vor.

  Lösung

  Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion:

  1. Die Probe mit der DNA-Zielsequenz wird auf etwa 94 °C erhitzt, woraufhin der DNA-Doppelstrang denaturiert und in seine Einzelstränge zerfällt.
  2. Die Temperatur wird auf 55–65 °C herunter gekühlt, während synthetisch hergestellte Primer an die DNA-Einzelstränge binden.
  3. Bei etwa 72 °C nutzen Taq-Polymerasen die Primer als Startpunkte und synthetisieren komplementäre DNA-Stränge.
  4. Doppelsträngige DNA entsteht. Die Anzahl an DNA-Fragmenten hat sich verdoppelt.
  5. Der Zyklus – bestehend aus Denaturierung, Hybridisierung und Polymerisation – kann nun erneut stattfinden, bis die replizierte DNA für nachfolgende Tests oder zur Profilerstellung ausreichend vorhanden ist.

• Stelle sowohl den Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion detailliert in einem Zyklus als auch die vervielfältigte DNA nach drei Zyklen dar.

  Tipps

  Die drei Schritte der Polymerase-Kettenreaktion werden solange wiederholt, bis genügend DNA vorhanden ist. Es werden meist etwa 20–50 Zyklen durchgeführt.

  Ausgehend vom DNA-Primer vervollständigt die Taq-Polymerase die DNA-Einzelstränge zu DNA-Doppelsträngen.

  Lösung

  Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion

  Die PCR erfolgt in den folgenden drei Schritten:
  1 – Den: Denaturierung
  2 – Hyb: Hybridisierung
  3 – Poly: Polymerisation

  Diese werden in Zyklen wiederholt, bis genügend DNA vorhanden ist:
  Zyklus 1: der erste Zyklus
  Zyklus 2: der zweite Zyklus
  Zyklus 3: der dritte Zyklus

  Für einen PCR-Vorgang benötigt man zusätzlich:
  Primer: DNA-Primer
  Nuk: Nukleotide
  Taq-P: Taq-Polymerase

  So wird aus wenig
  A-DNA: Ausgangs-DNA (eine DNA-Probe)
  viel identische
  S-DNA: synthetisierte DNA.

• Begründe die Wichtigkeit der Temperatur während der Hybridisierung anhand eines spezifischen Primers.

  Tipps

  Die Anlagerungs- und Schmelztemperaturen von Primern unterscheiden sich um ca. 3 °C.

  Bei zu hohen Temperaturen schmilzt DNA, so auch die, aus der Primer bei der PCR bestehen. Dieser Vorgang äußert sich im Zerbrechen der Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen.

  Lösung

  Richtige Temperatur
  Die optimale Anlagerungstemperatur liegt meist etwa 3 °C unterhalb der Schmelztemperatur des Primers, in diesem Fall also bei 60 °C. Diese Temperatur erlaubt die Hybridisierung zwischen Primer und DNA-Zielsequenz und verhindert gleichzeitig die Bildung fehlerhafter Bindungen.

  Zu niedrige Temperatur
  Ist die Anlagerungstemperatur zu niedrig, in diesem Fall 55 °C, kommt es möglicherweise zu fehlerhaften Bindungen zwischen Primer und DNA-Zielsequenz. Der Primer bildet hierbei eine lockere Bindung zu weniger homologen Bereichen der Zielsequenz. Dieser Vorgang heißt auch Fehlpriming und führt zu unerwünschten Produkten, die nicht mit der Zielsequenz übereinstimmen.

  Zu hohe Temperatur
  Steigende Temperaturen brechen solche Verbindungen auf, weil ihre Bindungsenergie nicht groß genug ist. Nur die maximale Übereinstimmung der Basenpaarung hat eine hohe Bindungsstärke zur Folge. Wird die Temperatur zu hoch, in diesem Fall 63 °C, kann selbst zwischen homologen Sequenzen keine Bindung entstehen, weil die Schmelztemperatur des Primers erreicht wird.

• Definiere einige Grundbegriffe der Polymerase-Kettenreaktion.

  Tipps

  Die Polymerase-Kettenreaktion wird immer dann genutzt, wenn nicht genügend DNA für eine DNA-Analyse vorhanden ist.

  Das Bakterium Thermus aquaticus (Abkürzung: Taq) lebt in Geysiren bei circa 70 °C.

  Lösung

  Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist die Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Abschnitts vor einer DNA-Analyse.
  Ein PCR-Zyklus besteht aus den Schritten Denaturierung, Hybridisierung und Polymerisation. Dieser Zyklus wird so oft wiederholt, bis genügend DNA-Material vorhanden ist.

  Bei dem ersten Schritt, der Denaturierung, wird der DNA-Doppelstrang durch Hitze in seine beiden Einzelstränge aufgebrochen.
  Bei der folgenden Hybridisierung bilden synthetisch hergestellte Nukleotidsequenzen, die Primer, die Ansatzstelle für Polymerasen.
  Beim letzten Schritt der PCR, der Polymerisation, wird die hitzestabile Taq-Polymerase verwendet, welche aus Bakterien gewonnen wird.

• Begründe die Nutzung verschiedener DNA-Polymerasen bei der PCR.

  Tipps

  Escherichia coli kommt unter anderem im menschlichen Darm vor. Welche Temperatur herrscht in unseren Eingeweiden?

  Die DNA-Polymerasen von Mikroorganismen werden häufig nach deren Artnamen benannt:

  Betrachte Thermus aquaticus und Pyrococcus furiosus etwas genauer.

  Lösung

  Die PCR wurde 1983 von Kary Mullis erfunden. Er nutzte zunächst das Enzym DNA-Polymerase I von E. coli, einem mesophilen Bakterium mit einem Temperaturoptimum von etwa 39 °C. Bei der Erhitzung der DNA denaturiert das Enzym und muss folglich bei jedem Zyklus neu hinzugegeben werden. Dadurch war die ursprüngliche PCR ein recht aufwändiger und ineffizienter Vorgang.

  Mittlerweile wird bei der PCR häufig die Taq-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium T. aquaticus verwendet, die ein Optimum von etwa 72 °C aufweist und auch höhere Temperaturen übersteht. Die Verwendung von DNA-Polymerasen aus wärmeliebenden Bakterien hat die PCR-Technologie deutlich verbessert und automatisiert.

  Taq-Polymerase ist günstig und schnell; allerdings produziert sie manchmal Fehler beim Kopieren, wodurch Mutationen in der DNA-Sequenz entstehen können. Werden sequenzexakte DNA-Klone benötigt, kann die aus dem thermophilen Archaebakterium Pyrococcus furiosus isolierte Pfu-Polymerase angewendet werden. Sie besitzt eine Korrekturlesefunktion.

  Während der Synthese des neuen DNA-Strangs in 5‘-3‘-Richtung, wird dieser fortlaufend in 3‘-5‘-Richtung auf Fehlpaarungen untersucht. Detektiert die Polymerase einen Fehler, wird dieser ausgebaut und durch das korrekte Nukleotid ersetzt. Dadurch ist die PCR langsamer aber genauer.