Klonierung – angewandte Gentechnik
Klonierung ist das Erstellen und Vervielfältigen von identischer DNA. Erfahre, wie cDNA hergestellt wird und warum Insulin so wichtig ist. Entdecke auch, wie Klonierung in der Nahrungsmittelindustrie eingesetzt wird. Interessiert? Weitere Informationen und interaktive Übungen findest Du im Text!

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Klonierung – angewandte Gentechnik Übung
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Erkläre, was man in der Molekularbiologie unter Klonierung versteht.
TippsErinnere dich, wie ein Plasmid aufgebaut ist und welche Eigenschaften es dem Bakterium verleiht, wenn es das Plasmid aufgenommen hat.
LösungDie Klonierung dient vor allem der Gewinnung und Vervielfältigung bestimmter DNA-Fragmente, wie beispielsweise dem Gen für Insulin.
Das gewünschte Gen wird, unter Verwendung von Restriktionsenzymen, in ein bakterielles Plasmid eingebracht. Das Plasmid wiederum wird zurück in eine Bakterienzelle transferiert. Um die Membran der Bakterien kurzfristig porös zu machen, werden sie mit Chemikalien oder elektrischen Impulsen behandelt. So kann das Plasmid von der Bakterienzelle aufgenommen werden.
Für die Selektion derjenigen Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben, dient ein Nährmedium, das mit einem Antibiotikum versetzt wurde.
Da sich auf dem Plasmid nicht nur das gewünschte Gen, sondern auch ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum befindet, sind alle Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben, resistent. Diese Bakterien wachsen auf dem Medium.
Wenn die Bakterien sich teilen, entstehen immer mehr Bakterien, die das Gen tragen und somit auch Insulin produzieren. Haben sich die Bakterien ausreichend vermehrt, werden sie so behandelt, dass das Insulin aus ihnen gewonnen werden kann.
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Benenne die Teilschritte des Klonierungsprozesses bei der Insulingewinnung.
TippsÜberlege, was passieren muss, bevor ein eukaryotisches Gen in einen prokaryotischen Organismus gebracht wird und wie sich der Aufbau der DNA unterscheidet.
LösungLos geht es mit der DNA-Isolation. Das Plasmid muss aus dem Bakterium und das Insulingen aus dem Menschen gewonnen werden.
Da das eukaryotische Gen des Menschen auch Introns enthält, muss das Gen in cDNA umgeschrieben werden. Bei der Transkription wird das Gen in mRNA umgeschrieben. Diese enthält keine Introns mehr. Mit Hilfe des Enzyms „Reverse Transkriptase" wird die mRNA in cDNA übersetzt.
Im folgenden Schritt müssen beide DNAs, das Plasmid und die cDNA des Insulingens mit dem gleichen Restriktionsenzymen geschnitten werden. Diesen Vorgang nennt man Restriktion.
Das Enzym Ligase sorgt nun dafür, dass die cDNA im Plasmid verbleibt. Sie "klebt" das Gen sozusagen in das Plasmid. Dieser Prozess heißt Ligation.
Das fertige Plasmid enthält nun das Gen für Insulin und ein Gen für Antibiotikasresistenz.
Das Plasmid muss nun wieder in Bakterien eingebracht werden, damit diese das Insulin produzieren können. Hierzu werden die Bakterien mit Chemikalien oder elektrischen Impulsen behandelt.
Welche Bakterien das Plasmid aufgenommen haben, wird mithilfe eines mit einem Antibiotikum versetzten Mediums festgestellt. Auf diesem Medium überleben nur diejenigen Bakterien, die das Plasmid aufgenommen haben und somit das Resistenzgen tragen.
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Gib an, welche Aussagen zur Klonierung richtig sind.
TippsÜberlege, bei welchem Vorgang mRNA entsteht und was sie von DNA unterscheidet.
Bakterien besitzen keine Enzyme für das Spleißen.
LösungFür Klonierungen wird immer cDNA verwendet, da nur DNA repliziert, also vom Bakterium vervielfältigt werden kann. mRNA entsteht bei der Transkription. Zwar haben sowohl cDNA als auch RNA keine Introns mehr, mRNA-Moleküle können aber nicht repliziert werden und sind somit unbrauchbar für Klonierungen. Die genomische DNA enthält hingegen Introns. Da bakterielle DNA jedoch keine Introns enthält, besitzen Bakterien auch keine Enzyme, um DNA zu spleißen.
mRNA und genomische DNA sind daher ungeeignet für Klonierungen.
Möchte man nun ein Gen in ein Plasmid einbringen, ist es wichtig, dass beide DNAs (Plasmid und Gen) mit demselben Restriktionsenzym geschnitten werden. Würde man unterschiedliche Enzyme verwenden, würden die entstandenen Enden nicht zusammenpassen und eine Ligation könnte nicht stattfinden.
Bakterien dienen bei der Klonierung der Vervielfältigung der DNA. Jeder Teilung eines Bakterium geht eine Replikation der DNA, also auch des Plasmids, voraus. Da sich Bakterien so schnell teilen, eignen sie sich besonders gut für Klonierungen.
DNA ist universell. Das bedeutet, dass jede DNA, egal aus welchem Lebewesen sie stammt, von einem anderen Lebewesen gelesen und auch in Proteine übersetzt werden kann. Bakterien vervielfältigen daher nicht nur das eingeschleuste Gen, sondern produzieren auch das entsprechende Protein, zum Beispiel Insulin.
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Stelle dar, um welche Klonierungsschritte es sich handelt.
TippsÜberlege, welche Enzyme nur an spezifischen Erkennungssequenzen wirken.
Erinnere dich, wo sich die DNA bei Bakterien und eukaryotischen Zellen befindet und überlege, was man machen muss, um an die DNA zu gelangen.
LösungUm DNA aus Bakterien oder eukaryotischen Zellen zu isolieren, muss die Zellmembran, und bei den eukaryotischen Zellen auch die Kernmembran, komplett zerstört werden. Nur so kommt man an die aufgereinigte DNA.
Für die Restriktion benötigt man Restriktionsenzyme. Jedes Restriktionsenzym hat eine spezifische Erkennungssequenz. Zum Beispiel erkennt das Enzym EcoRI aus dem Darmbakterium E.coli die Sequenz GAATTC. Demnach müssen die entsprechenden Sequenzen sowohl im Plasmid als auch im DNA-Fragment zu finden sein.
Wurden beide DNAs geschnitten und das Fragment in den Vektor eingebaut, müssen die Schnittstellen noch verklebt werden. Das macht das Enzym Ligase. Die Ligase kennst du schon von der Replikation. Dort ist sie für das Zusammenkleben der Okazaki-Fragmente verantwortlich.
Der Transfer des fertigen Plasmids in eine Bakterienzelle wird auch als Transformation bezeichnet. Wie du im Video gelernt hast, werden die Bakterien hierfür mit Chemikalien oder elektrischen Impulsen bearbeitet. Diese Verfahren machen die Membran der Bakterien porös und löchrig, sodass die Plasmide aufgenommen werden können. Führt man diese Behandlungen aber zu lange durch, sterben die Bakterien ab, da sie ihre Membran dann nicht mehr reparieren können.
Der letzte wichtige Schritt bei der Klonierung ist die Selektion. Mithilfe von Antibiotika filtert man diejenigen Bakterien heraus, die das Plasmid aufgenommen haben. Alle anderen sterben, da sie nicht resistent gegen das Antibiotikum sind. Würde man diese Selektion nicht durchführen, würden sich alle Bakterien, mit oder ohne Plasmid, vermehren. So würde zwar in kurzer Zeit eine große Masse an Bakterien entstehen, die Ausbeute an dem gewünschten Genprodukt wäre aber viel geringer.
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Erkläre, wie aus genomischer DNA cDNA hergestellt werden kann.
TippsWas ist der Unterschied zwischen der prä-mRNA und der reifen mRNA?
Die cDNA enthält keine Introns.
LösungIm ersten Schritt wird die genomische DNA transkribiert. Es entsteht prä-mRNA. Diese enthält sowohl Exons als auch Introns. Im nächsten Schritt wird die prä-mRNA gespleißt, sodass nur noch die codierenden Bereiche, also die Exons, übrig bleiben. Das ist die reife mRNA. Diese mRNA wird nun für die reverse Transkription genutzt und mithilfe des Enzyms „reverse Transkriptase“ zu cDNA umgeschrieben.
Die cDNA kann dann in einem Plasmid kloniert werden.
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Zeige auf, welche Replikationsenzyme für die Klonierung geeignet sind.
TippsGehe die einzelnen Enzyme der Reihe nach durch und überlege, welche du ausschließen kannst.
Überlege, wo auf keinen Fall geschnitten werden darf.
LösungGehen wir die Enzyme der Reihe nach durch:
XbaI: Insulingen: XbaI schneidet außerhalb des Gens und ist somit für das Insulingen geeignet. Es schneidet aber auch innerhalb des Resistenzgens. Würde man also das Plasmid mit XbaI schneiden, würde sich das Insulingen zwischen die beiden XbaI-Schnittstellen setzen. Somit würde ein Teil des Resistenzgens fehlen und es würde nicht mehr funktionieren.
SmaI: SmaI schneidet außerhalb des Insulingens und ist somit für diese DNA geeignet. SamI hat auch eine Schnittstelle im Plasmid. Dort kann das Enzym den Ring aufschneiden und das Insulingen kann eingefügt werden. SmaI würde somit funktionieren.
EcoRI: EcoRI schneidet ebenfalls außerhalb des Insulingens und wäre somit für diese DNA geeignet. Im Plasmid schneidet EcoRI aber an zwei Stellen, wovon eine innerhalb des Startpunktes für die Replikation liegt. Würde sich das Insulingen dort in den Ring setzten, wäre der Startpunkt zerstört und das Plasmid könnte nicht mehr repliziert, also vermehrt werden.
PstI: PstI hat eine gut geeignete Schnittstelle innerhalb des Plasmids. Allerdings schneidet PstI innerhalb des Insulingens, sodass dieses zerstört werden würde.
SmaI ist demnach das einzige Enzym, dass für die Klonierung verwendet werden kann.
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