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Transkript PCR – Polymerasekettenreaktion

Hallo, heute geht es um die Polymerase-Kettenreaktion. Die Polymerase-Kettenreaktion wird eingesetzt um einen kurzen genau definierten Teil eines DNA-Stranges zu vervielfälltigen. Die englische Bezeichnung ist "Polymerase Chain Reaction" und die Abkürzung dafür lautet PCR. Die PCR zählt zu den wichtigsten Methoden der modernen Molekularbiologie und viele wissenschaftliche Fortschritte auf diesem Gebiet, zum Beispiel die Entschlüsselung des menschlichen Genoms oder die Entwicklung der Gentherapie wären ohne diese Methode nicht denkbar gewesen. Für die Durchführung der PCR benötigt man nur wenige grundlegende Komponenten: ein Reaktionsgefäß, einige Reagenzien und eine Wärmequelle, um von einem DNA-Abschnitt tausende identische Kopien herzustellen. Schauen wir uns diese Komponenten genauer an. Zuerst benötigen wir ein kleines Reaktionsgefäß, meist aus Plastik, in dem die Reaktion stattfinden kann. Dann braucht man eine Flüssigkeit, in der die Reaktion passiert. Dazu verwendet man einen so genannten Puffer, der dafür sorgt, das der optimale pH-Wert herrscht. Natürlich brauchen wir die originale DNA, die den zu vervielfälltigenden Abschnitt enthält. Diese DNA nennt man Template. Eine weitere Vorraussetzung für die Reaktion ist die Anwesenheit des Enzyms DNA-Polymerase. Die DNA-Polymerase habe ich bereits in einem anderen Video vorgestellt. Die Polymerasen, die für die PCR verwendet werden, sind im Gegensatz zur menschlichen Polymerase bis fast 100 Grad Celsius hitzestabil. Diese Enzyme werden aus Bakterien gewonnen, die in heißen Quellen leben. Ein Beispiel ist die Taq-Polymerase aus dem Bakterium Termus aquaticus. Dem Reaktionsansatz werden noch Magnesium-Ionen zugesetzt, die notwendig sind, damit die DNA-Polymerase funktioniert. Wenn wir neue DNA herstellen wollen, brauchen wir auch noch die Bausteine aus denen ein neuer DNA-Strang aufgebaut werden kann, die Nukleotide. DNA-Polymerasen können neue Nukleotide nur an das 3-Strich-Ende einer bereits bestehenden Kette von Nukleotiden anfügen. Deshalb müssen wir auch noch solche Anfangsstücke hinzufügen. Diese werden Primer genannt. Abhängig von ihrer Sequenz binden sie an bestimmten Stellen und bilden so die Startpunkte der DNA-Synthese. Will man also einen ganz bestimmten DNA-Abschnitt vermehren, muss man mindestens die Sequenz am Anfang und am Ende dieses Abschnitts kennen um die richtigen Primer herstellen zu können. Wenn wir also alle nötigen Komponenten in unser Reaktionsgefäß gegeben haben, stellen wir dieses in einen so genannten Themocycler. Im Thermocycler durchläuft die Probe viele Zyklen in denen sie erhitzt und abgekühlt wird. Jeder Zyklus besteht aus mehreren Temperatur-Schritten. Im ersten Schritt wird die doppelsträngige DNA auf 94 bis 96 Grad Celsius erhitzt, um die Stränge zu trennen. Durch das Erhitzen werden die Wasserstoff-Brücken-Bindungen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten aufgebrochen. Dieser Vorgang wird Denaturieren oder Schmelzen genannt. Im nächsten Schritt wird das Reaktionsgefäß etwas abgekühlt und circa 30 Sekunden lang auf einer Temperatur gehalten, die eine spezifische Anlagerung der Primer an die DNA erlaubt. Die genaue Temperatur wird hierbei durch die Länge und die Sequenz der Primer bestimmt und liegt meist zwischen 55 und 65 Grad Celsius. Dieser Schritt wird Primerhybridisierung genannt. Die DNA-Polyerasen binden an die DNA-Einzelstränge und füllen die Stränge mit freien Nukleotiden auf. Sie beginnen am 3-Strich-Ende der angelagerten Primer und folgen dann dem DNA-Strang. Die Primer werden nicht wieder abgelöst. Sie bilden die Anfänge der neuen Einzelstränge. Die Temperatur hängt vom Arbeitstoptimum der verwendeten DNA-Polymerase ab. Die Dauer dieses Temeratur-Schrittes ist abhängig von der Länge des DNA-Abschnittes, der vervielfälltigt werden soll, sowie von der verwendeten DNA-Polymerase, und dauert meist zwischen 30 Sekunden und 2 Minuten. Diese Zyklen von Denaturieung, Primerhybridisierung und Elongation werden 12 bis 50 mal wiederholt. Im ersten Zyklus entstehen pro DNA-Ausgangsdoppelstrang zwei neue DNA-Stränge, welche im Bereich der Zielsequenz doppelsträngig sind. Den Primer habe ich hier rot dargestellt, nicht hellblau wie vorher. Nach dem Schmelzen, am Anfang des zweiten Zyklus, stehen dadurch die beiden ursprünglichen DNA-Einzelstränge und zwei am 3-Strich-Ende uberlange Einzelstränge zu Verfügung. Dies ist damit zu erklären, dass lediglich ein Startpunkt, nicht aber ein Endpunkt, exakt festgelegt ist. Der Abbruch der Strangsynthese erfolgt dabei spätestens durch die Strangtrennung im folgenden Denaturierungsschritt. Im zweiten Zyklus stehen die eingesetzte DNA sowie die gerade gebildeten DNA-Stränge zur Verfügung. Solange genug DNA-Polymerasen, Primer und Nukleotide zur Verfügung stehen, wird die DNA bei jedem Schritt verdoppelt. Sie vermehrt sich also exponentiell. Wenn alle Zyklen abgeschlossen sind, werden alle Proben auf 4 bis 8 Grad abgekühlt und können so einige Stunden stehen bleiben, bis sie weiterverarbeitet werden. Meist werden die entstandenen DNA-Stücke später mit Hilfe der Gelelektrophorese der Größe nach aufgetrennt. Die Gelelektrophorese habe ich im Video "Genetische Fingerabdruck" bereits kurz erklärt. Ein wesentlicher Bestandteil der Polymerase-Kettenreaktion PCR ist also die DNA-Polymerase. Der Begriff Kettenreaktion bescheibt die Tatsache, das die Produkte vorheriger Zyklen als Ausgangsstoffe für den nächsten Zyklus dienen. Und was herauskommt, ist jede Menge eines bestimmten DNA-Abschnitts. So wenn ihr jetzt noch Fragen habt, dann schreibt einen Kommentar, ansonsten bedanke ich mich für das Zuschauen. Bis zum nächsten Mal.

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19 Kommentare
  1. Serpil

    Hallo,
    das kann ich dir erklären. Bei einer PCR-Analyse, die der DNA-Typisierung dienen soll, wird die sogenannte Mikrosatelliten-DNA vervielfältigt. Die Mikrosatelliten sind nicht-codierende Bereiche unserer DNA, die bei jedem Menschen unterschiedlich lang sind. Sie sind charakterisiert dadurch, dass sich eine bestimmte Basenabfolge mehrfach wiederholt (bspw. ACACACACACAC oder auch AAAAAAAAAAA). Diese DNA-Abschnitte sind nur bei eineiigen Zwillen identisch. Teilweise übereinstimmende Banden weisen auf eine Verwandschaft hin.
    Wenn man also Tatortspuren hat, kann man anhand dieser Mikrosatelliten überprüfen, ob das Bandenmuster von Verdächtigten mit diesen übereinstimmt.
    Ich hoffe, das hilft dir weiter!
    LG

    Von Serpil Kilic, vor 10 Monaten
  2. Default

    Hallo,
    ich habe leider immer noch nicht wirklich verstanden, wie es dazu kommt, dass die DNA-Fragmente unterschiedlich lang sind. Werden da, anders als in der Literatur angegeben, mehr als zwei unterschiedliche Primer hinzugegeben oder worauf ist dies zurückzuführen? In allen Abbildungen, die sich zur PCR finden lassen, entstehen letztendlich immer gleich lange DNA-Fragmente, die dann jedoch bei der Gelelektrophorese in unterschiedliche Banden aufgetrennt werden (sollen). Das kann ich nicht nachvollziehen! Überall steht, dass die PCR die Grundlage für die Gelelektrophorese und die Identifikation von Tätern bildet, jedoch wird nirgends erklärt, wie es zu den unterschiedlich langen Banden kommt... Es wäre toll, wenn mir da jemand weiterhelfen könnte!

    Von La Naschmidt, vor 11 Monaten
  3. Default

    ich muss sagen,dass es bisschen schnell ist :/

    Von Jessiehh, vor 12 Monaten
  4. Haare 2

    Der zu vervielfältigende DNA Abschnitt wird durch die zugegebenen Primer festgelegt, die am Ende und am Anfang des zu vervielfältigenden Abschnitts an die DNA binden.

    Von Dicty, vor mehr als einem Jahr
  5. Default

    Hallo :-)
    Wird der DNA Abschnitt, der bei der PCR vervielfältigt wird, vorher mit Restriktionsenzymen aus der DNA ausgeschnitten oder wird der komplette DNA Strang bei der PCR vervielfältigt?

    Von Jule Zieher, vor mehr als einem Jahr
  1. Marcel

    Hallo :)
    Die Polymerase stoppt die Replikation spätestens beim erneuten Denaturieren der Doppelstränge (je nach dem wie lange man den Zyklus also einstellt). Die Überhang des neu synthetisierten Stranges beruht tatsächlich darauf, dass die Polymerase bei der "Ursprungs-DNA" (also die die vor dem ersten Zyklus hinzu gegeben wurde) keinen Endpunkt hat. Ab dem zweiten Zyklus liegen aber auch "neue DNA-Stränge" vor (Primer+ neue DNA-Fragmente beliebiger Länger). An diesem neuen Strang (egal wie lang der ist) setzt nun wieder ein Primer an eine spezifische Stelle an (die ist durch den Primer definiert). Nun synthetisiert die Polymerase wie in 5´-3´Richtung (also in die Richtung in der der Primer des Matritzenstranges sitzt und nicht in die Richtung der beliebigen Länge). Irgendwann gibt es daher keine Matritze mehr und die DNA-Replikation stoppt. So entstehen Stränge definierte Länge. Frag ruhig wenn du noch Fragen hast, das Thema ist schons ehr komplex wie du merkst :)

    Von Marcel Schenke, vor mehr als einem Jahr
  2. Default

    Hallo:) bei 4:34 wird gesagt, dass der doppelstrang am 3`-Ende länger ist, da der Endpunkt nicht festgelegt ist.Aber liegt es nicht daran, dass die taq polymerase das Stück als Ansatzstelle für die Replikation benötigt? Und wann hört die taq-Polymerase mit der Replikation auf?

    Von Dina Chouli, vor mehr als einem Jahr
  3. Haare 2

    Der neue Strang ist nicht leer, er entsteht indem die Polymerase Nucleotide aneinander hängt.

    Von Dicty, vor fast 2 Jahren
  4. Default

    Hallo, wie ensteht dann den der neue ("leere" ) Strang bei dem die Polymerase die Nucleotide noch einfügen muss?

    Von Noah Raffenberg, vor fast 2 Jahren
  5. Nadja

    Ja, genau :). Das Enzym DNA-Polymerase katalysiert an einem DNA-Einzelstrang die Synthese eines neuen komplementären DNA-Strangs. Dies macht die DNA-Polymerase indem sie neue Nukleotide an eine bereits bestehende Kette von Nukleotiden (DNA-Einzelstrang) anfügt.

    Von Nadja B., vor fast 2 Jahren
  6. Default

    Was ist nun dietatsächliche Aufgabe der DNA-Polymerase? Ich hab dein Video zu DNA-Polymerase schon angeschaut.
    Ist ihre Aufgabe die Nucleotide an den DNA-Einzelstrang nazuheften?

    Von Annalena 5, vor fast 2 Jahren
  7. Haare 2

    Hallo Marcel, du meintest wahrscheinlich im letzten Satz Deiner Antwort wahrscheinlich die Aktivität der DNA-Polymerase?
    Die DNA-Polymerase kann prinzipiell bis zum Ende des vorliegenden Stranges synthetisieren oder bis durch eine Temperaturerhöhung die Elongation gestoppt wird.

    Von Dicty, vor mehr als 2 Jahren
  8. Marcel

    Hallo :)
    Der Strang wird bei der Replikation nicht kürzer. Am Ende liegen 2 komplementäre DNA-Stränge vor. Die Polymerase benötigt übrigens tatsächlich keinen Terminator. Sie synthetisiert theoretisch solange einen DNA-Strang, solange auch ein Matrizenstrang und die nötigen Moleküle vorhanden sind. Bei einer Ringförmigen Bakterien-DNA also solange bis der gesamte Ring aus einem Doppelstrang besteht. Bei der PCR ist die Aktivität der DNA aber zusätzlich über die Temperatur reguliert.

    Von Marcel Schenke, vor mehr als 2 Jahren
  9. Default

    Werden die DNA Stränge nach jeder Replikation kleiner?

    Von Juliapeisker, vor mehr als 2 Jahren
  10. Default

    Die DNA wird ab dem Primer repliziert aber woher weiß die Polymerase wann mit der Replikation abgebrochen werden kannn? Es gibt bei den Introns doch keine Terminator oder?

    Von Juliapeisker, vor mehr als 2 Jahren
  11. Default

    Etwas zu schnell;)

    Von A Klasner, vor mehr als 2 Jahren
  12. Mara

    Sehr gut erklärt! :)

    Von Mara Luisa M., vor fast 3 Jahren
  13. Default

    Danke, das ist mit ein paar Streichungen das, was auch im Wikipedia Artikel unter Polymerasekettenreaktion zu finden ist.

    Von Gimmeanick, vor etwa 3 Jahren
  14. Default

    Hallo Dicty,
    ein geniales Video super einfach erklärt, vielen Dank! Es hat mir sehr weitergeholfen.

    Von Anna Hosiner, vor mehr als 3 Jahren
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