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DNA-Sequenzierung 05:07 min

Textversion des Videos

Transkript DNA-Sequenzierung

Hallo. In diesem Video geht es um die Sequenzierung der DNA. Der Begriff Sequenzierung bezieht sich auf die Bestimmung der Reihenfolge der Nukleobasen, also die Basensequenz in einem DNA-Strang. Der Einfachheit halber nehmen wir hier nur ein kurzes Stück DNA. Zur Sequenzierung wurden unterschiedliche Methoden entwickelt. Ich werde euch die Methode vorstellen, die heute in den meisten modernen Laboren angewendet wird. Für diese Methode der Sequenzierung gibt es mehrere synonyme Bezeichnungen. Sequenzierung nach Sanger Desoxymethode oder Kettenabbruchmethode. Bei dieser Methode wird zuerst der zu sequenzierende DNA-Abschnitt mithilfe der polymerasen Kettenreaktion vervielfältigt. Über die DNA-Polymerase und die polymerase Kettenreaktion habe ich schon in einem anderen Video gesprochen. Bei der PCR zur Sequenzierung der DNA werden nicht beide Einzelstränge des Doppelstrangs, sondern nur ein Strang vervielfältigt und das nicht nur einmal, sondern viele Tausend Male.

In dem Video über die DNA-Polymerase habt ihr gesehen, dass zum Aufbau eines neuen DNA-Strangs Nukleotide notwendig sind. Diese bestehen aus einem Zuckermolekül der Desoxyribose, einem Phosphatsäurerest oder Phosphat und einer von vielen Nukleobasen. Im Reaktionsgemisch für die PCR sind sehr viele Nukleotide enthalten, dadurch sind genug Bausteine für den neuen Aufbau der DNA-Stränge vorhanden. Die DNA-Polymerase kann neue Nukleotide nur an die OH-Gruppe am dritten C-Atom des Zuckermoleküls des vorhergehenden Nukleotids anhängen. Der Trick der Sanger-Methode der Sequenzierung ist nun, dass in den Reaktionsansatz auch Nukleotide gegeben werden, denen die OH-Gruppe fehlt, sogenannte Didesoxynukleotide. Daher auch der Name Desoxymethode. Die Nukleotide werden genau wie die anderen in den neuen Strang eingebaut, allerdings kann dieser dann nicht weiter verlängert werden. Die Kette bricht ab. Deshalb heißt die Methode auch Kettenabbruchmethode.

Für die Sequenzierung verwendet man 4 Ansätze mit jeweils der gleichen Ausgangs-DNA. In jeden Ansatz kommt eine Mischung von normalen Nukleotiden und Didesoxynukleotiden mit jeweils einer bestimmten Nukleobase. Die Didesoxynukleotide sind Didesoxythymidintriphosphate, Didesoxyadenintriphosphate, Didesoxyguanintriphosphate und Didesoxycytosintriphosphate. Bei der PCR werden in vielen Zyklen immer wieder neue Stränge aufgebaut. Wird beim Aufbau des neuen Stranges anstelle eines normalen Nukleotids zufällig ein Didesoxynukleotid eingebaut, bricht die Synthese des neuen Strangs ab. Am Ende gibt es also tausende Stränge unterschiedlicher Länge, vielmehr als der DNA-Strang, den ich sequenzieren will, Basen hat. Die unterschiedlich langen Stränge werden jetzt durch Gelelektrophorese der Größe nach sortiert und sichtbar gemacht. Lange DNA-Stränge wandern langsamer durch das Gel als kurze, das heißt im unteren Bereich des Gels sind die kurzen DNA-Stränge und im oberen die längeren. Da ich weiß welches Didesoxynukleotid in welchem Ansatz ist kann ich jetzt anhand der Länge der Stücke die Sequenz ablesen. Heute verwendet man nur noch einen Reaktionsansatz, in dem man alle vier Didesoxynukleotide gibt. Um sie unterscheiden zu können, werden sie vorher mit Fluoreszenzfarbstoffen in verschiedenen Farben markiert. Disdesoxy-ATP meist in grün, Didesoxy-CTP in blau, Didesoxy-GTP in gelb und Disdesoxy-TTP in rot. Nach der PCR kommt dann die Mischung der unterschiedlich langen DNA-Stränge nicht auf ein Gel, sondern in eine Maschine, den sogenannten Sequenzer. Dort werden die DNA-Stücke auch nach ihrer Größe sortiert und kommen dann an einen Detektor vorbei, der die Farbe misst, mit der sie am Ende markiert sind. So erhält man dann die Abfolge der Basen im DNA-Strang. Mithilfe dieser Methode können nur DNA-Stränge sequenziert werden, die kürzer als tausend Basenpaare sind.

Wenn also ein längeres DNA-Stück oder gar ein ganzes Genom sequenziert werden soll, wird die entsprechende DNA erst in kleine Teile zerlegt, die sich an den Enden überlappen müssen. Durch diese Überlappung können sie später mithilfe der Sequenz zusammengefügt werden. Die Entwicklung dieser Methode durch Frederick Sanger war ein Meilenstein für die Biotechnologie und ermöglichte erst die Sequenzierung des menschlichen Genoms. Außerdem ist sie die Grundlage für die Erforschung der genetischen Information. Das war ein kurzer Überblick über die Kettenabbruchmethode, wenn ihr noch Fragen habt, schreibt einen Kommentar. Tschüss und danke fürs Zuschauen!

Informationen zum Video
20 Kommentare
  1. Haare 2

    Dadurch, dass von der Original DNA nicht nur eine Kopie sonder meist viele vorhanden sind, die dann mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten werden, entstehen Teilstücke deren Sequenzen sich überschneiden. Durch diese Überschneidungen kann man feststellen welche Fragmente hintereinander gehören.

    Von Dicty, vor fast 2 Jahren
  2. Default

    In der Schule behandeln wir momentan das "Human-Genom-Projekt" hierbei ist die Rede von der Schrot-Schuss-Methode. Die verschiedenenRestriktionsemzym verdauen hierbei die genomische DNA. Es entsteht eine Reihe von DNA-Fragmenten, deren Sequenz sich z.T. Überlappen. Diese werden wiederum in einem MO kloniert und durch die Sanger-Sequenz-Methode sequenziert... Wie kann ich nun wissen, welche Fragmente nebeneinander gehören?

    Von Annalena 5, vor fast 2 Jahren
  3. Haare 2

    Die negativ geladenen DNA-Stücke wandern zum Pluspol (nach unten). Dabei wandern die kleinen Stücke schnelle durch das netzartige Gel als die Großen. Also sind oben die große Stücke und unten die kleinen. Um die Größe der Stücke festzustellen, lässt man in einer Spur, meist am Rand, noch eine Mischung mit DNA-Stücken bekannter Größe mitlaufen, die sogenannte DNA-Leiter: http://de.wikipedia.org/wiki/DNA-Leiter
    Daran kann man auch die Größe der anderen Stücke ablesen.

    Jetzt klarer?

    Von Dicty, vor mehr als 2 Jahren
  4. Default

    Eine frage, ich würde gerne wissen wie man diese DNA-Banden eigentlich abliest, von unten nach oben oder von oben nach unten und warum
    vielen dank im voraus:)

    Von A Klasner, vor mehr als 2 Jahren
  5. Haare 2

    Du hast das schon richtig erkannt. Es kommt auf den Primer an. Häufig gibt es DNA-Abschnitte die bei vielen Individuen einer Art oder sogar bei mehreren Arten gleich sind. Da kann ich dann mit meinem Primer ansetzten.

    Von Dicty, vor etwa 3 Jahren
  1. Default

    Auszug Text: Bei der PCR zur Sequenzierung der DNA werden nicht beide Einzelstränge des Doppelstrangs, sondern nur ein Strang vervielfältigt und das nicht nur einmal, sondern viele Tausend Male.

    FRAGE: Wie erhalte ich/sortiere ich einen Einzelstrang zur Vervielfertigung aus? Oder bleibt einfach alles in einem Gefäß und wird nur nicht synthetisiert, weil ich nur eine Sorte Primer habe?!

    Und woher kenne ich den Abschnitt auf dem DNA-Abschnitt um den passenden Primer zu kreieren?

    Bin verwirrt... :-(

    Von Mieze1985, vor etwa 3 Jahren
  2. Haare 2

    Zur Replikation: Es werden immer die gleichen Stänge verdoppelt, da nur Primer mit genau der gleichen Sequenz eingesetzt werden. Das bedeutet, diese Primer (="Startstückchen") können nur an einer bestimmten Stelle binden und dann werden an dieses "Startstückchen" die Nukleotide, komplimentär zum anderen Strang angebaut.
    Die unterschieldichen Längen entstehen dadurch, dass ganz zufällig die Desoxynukleotde eingebaut werden (in der Mischung sind sowohl Normale- als auch Desoxynukleotide), wodurch dann keine weiteren Nukleotide angebaut werden können und die Kette abbricht. Klar?

    Von Dicty, vor mehr als 3 Jahren
  3. Default

    Hallo ! Habe eigentlich bis auf die Replikation der DNA alles verstanden . Nun zur Replikation: Wie geht es das immer die gleichen DNA Einzelstränge verdoppelt werden und wie entstehen dann die unterschiedlichen Längen der DNA Stränge ?

    Von Gröning, vor mehr als 3 Jahren
  4. Haare 2

    Hallo Amy, ich versuchs noch mal:
    Es wird nur einer der beiden Doppelstränge neu synthetisiert, ganz oft, viele Male. Dabei wir zufällig, früher oder später ein Didesoxynukleotide eingebaut und die Synthese bricht ab.
    Am Ende hat man ganz viele unterschiedlich lange Stränge. Wenn man die der Größe nach sortiert und weiß, bei welchem Nukleotid der Abbruch erfolgt ist, dann kennt man auch die Sequenz.

    Da die DNA-Stränge sehr klein sind verwendet man zum Sortieren ein Gel, das ist wie ein dreidimensionales Netz. Die DNA ist negativ geladen und wandert deshalb, wenn man Strom anlegt, zum +Pol. Die kurzen Stränge kommen schneller durch die Poren des Gels als die langen, und sind deshalb weiter unten.
    Jede Bande im Gel besteht aus DNA-Strängen, die die selbe Länge haben und deshalb gleich schnell gewandert sind (gestartet sind alle Stränge gleichzeitig am oberen Ende des Gels).

    Vielleicht ist es jetzt klarer, sonst frag noch mal.

    Von Dicty, vor mehr als 3 Jahren
  5. Default

    ja das habe ich verstanden :) Ich verstehe aber auch nicht wieso man am Ende, dadurch dass die Teile unterschiedlich schnell wandern(aufgrund ihrer länge und Ladung)Die Reihenfolge wie sie im Dna Strang vorkommen ablesen kann. Also von unten nach oben schreibt man den Strang ja dann auf und wenn man den komplementär macht, hat man den Strang der DNA. Aber inwiefern zeigt den die Ladung und Länge die Abfolge der Nucleotide an?

    Von Amy94, vor mehr als 3 Jahren
  6. Marcel

    Hallo Amy, das wichtigste: Es gibt keine doofen Fragen, weißt du doch. Frag immer wenn du dir unsicher bist ;)
    Wichtig ist. Du hast nach einigen Schritten ja ein Gemisch von vielen Kopien deines DNA-Einzelstranges. Diese werden dann in 4 unterschiedliche Gefäße gegeben und die besonderen Didesoxynukleotide werden dazu gegeben. Natürlich werden auch normale Nucleotide hinzu gegeben. Deine Einzelstrangkopien werden in den 4 neuen Gefäßen nun wieder zu einem Doppelstrang vervollständigt. Dabei stoppt die Synthese aber immer wenn eines dieser besonderen Didesoxynucleotide eingebaut wird. Somit werden deine Einzelstrangkopien alle ganz unterschiedliche lang vervollständigt. Denn es ist ja Zufall ob grade ein richtiges Nucleotid "angeschwommen" kommt oder ein Didesoxynucleotid.
    Hast du es soweit verstanden? Dann würde ich dir auch noch den letzten wichtigen Schritt erläutern.

    Von Marcel Schenke, vor mehr als 3 Jahren
  7. Default

    Hallo :) Ich habe mir Die DNA Sequenzierung jetzt schon einige Male durchgelesen und den Ablauf auch soweit verstanden. Irgendwie verstehe ich aber immer noch nicht, wieso man nachher die DNA Basensequens ablesen kann.
    Wieso geht das denn? Also am Ende Zeigt dieses Gel ja die komplemänteren Nucleotide zu der der Dna an oder? Und wieso? Ich wetter die Frage ist doof aber ich verstehe es irgendwie nicht.

    Von Amy94, vor mehr als 3 Jahren
  8. Haare 2

    Für jede die vier Basen brauch ich jeweils einen Ansatz, sonst kann ich die Basen hinterher nicht mehr unterscheiden und somit auch die DNA-Sequenz nicht bestimmen.
    Die Sequenz des DNA-Abschnitts kennt man natürlich erst nach dem Sequenzieren.
    DNA kann man z.B. aus einem Mundschleimhautabstich gewinnen, wenn man einen Vaterschaftstest machen will oder aus Blut von einem Tatort.
    Meistens ist in so einer Probe zu wenig DNA um sie (in einem Gel) sichtbar zu machen. Deshalb muss ich sie vorher vervielfältigen.

    Von Dicty, vor fast 4 Jahren
  9. Default

    und der sequenzierende DNA Abschnitt woher kennt man den und wieso muss ich die DNA vervielfältigen

    Von Siyar Y., vor fast 4 Jahren
  10. Default

    wieso braucht man 4 Ansätze ?

    Von Siyar Y., vor fast 4 Jahren
  11. Who is who 40

    Hallo Tantan90,
    wir haben deinen Wunsch erhört und danken dir für dein Feedback. Wir sind gerade dabei in Bio viele Videos zu produzieren und werden versuchen deinen Wunsch zu berücksichtigen.
    Viele Grüße
    Mandy

    Von Mandy F., vor mehr als 4 Jahren
  12. Default

    Vielen dank, ich habe ein Feednack abgegeben, vielleicht kommt ja was zurück.

    Von Tantan90, vor mehr als 4 Jahren
  13. Haare 2

    Genregulation ist ein komlexes Thema zu dem man sicherlich mehrere Videos machen könnte. Da ich im Momnt keine Videos produziere empfehle ich dir das Thema vorzuschlagen:
    http://www.sofatutor.com/feedback/new
    Hoffentlich findet sich dann bald ein Autor der sich damit beschäftigt.

    Von Dicty, vor mehr als 4 Jahren
  14. Default

    Hallo, ich bräuchte ein Video über die Genregulation, gibt es dazu schon eins??? Wenn nicht wäre es toll wenn Sie vielleicht eins machen könnten. Danke :)

    Von Tantan90, vor mehr als 4 Jahren
  15. Default

    wicklich gut erklärt danke... ich schreibe morgen eine bioklausur

    Von Jl Girl2, vor fast 6 Jahren
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